كيف تحضّر مزيجًا رئيسيًا لـ PCR

لماذا المزيج الرئيسي

سحب كل مكوّن في كل أنبوب بطيء ويضيف خطأ صغيرًا في كل مرة. يجمع المزيج الرئيسي في أنبوب واحد كل ما تشترك فيه التفاعلات، ثم يُوزَّع على الأنابيب قبل إضافة القالب. تتلقى كل التفاعلات المزيج نفسه وتسحب أحجامًا صغيرة أقل بكثير.

التراكيز النهائية المعتادة

• المحلول المنظِّم: 1× (من مخزون 10× أو 5×).
• dNTP: ‏0.2 mM من كل منها.
• MgCl₂: من 1.5 إلى 2.5 mM، إن لم يكن في المحلول المنظِّم أصلًا.
• البادئات: من 0.1 إلى 0.5 µM لكل منها.
• بوليميراز Taq: نحو 1.25 وحدة لكل تفاعل 50 µL.
• القالب: من 1 pg إلى 100 ng، حسب مصدره.

اتبع دليل البوليميراز لديك حين يختلف؛ للإنزيمات عالية الدقة توصياتها الخاصة.

حساب الأحجام

لكل مكوّن، الحجم لكل تفاعل = التركيز النهائي ÷ تركيز المخزون × حجم التفاعل. في تفاعل 25 µL، يحتاج المحلول المنظِّم 10× إلى 2.5 µL وكل بادئة من 10 µM إلى 0.5 µM ‏1.25 µL. ويكمل الماء الحجم بعد القالب.

اضرب كل حجم في عدد التفاعلات زائد نحو 10%، لأن بعض السائل يضيع في الرؤوس والجدران. لـ 10 تفاعلات، حضّر لـ 11.

تجميع المزيج

1. أذب المكونات على الثلج، ورجّها واطردها مركزيًا لفترة قصيرة (عدا البوليميراز).
2. أضف الماء أولًا ثم المحلول المنظِّم وdNTP وMgCl₂ والبادئات.
3. أضف البوليميراز أخيرًا، وامزج بلطف بالماصة أو بالنقر على الأنبوب واطرد مركزيًا.
4. وزّع المزيج على الأنابيب وأضف إلى كل منها قالبه. أضف ضابطًا دون قالب بالماء.

الحاسبات

تحسب حاسبة المزيج الرئيسي لـ PCR كل الأحجام لأي عدد من التفاعلات. تحقق من درجة حرارة تلدين بادئاتك بـ حاسبة Tm للبادئات وحضّر مخزوناتها بـ حاسبة إعادة تعليق قليلات النيوكليوتيد.