كيف تحضّر هلام SDS-PAGE

كيف يعمل الهلام

يغلف SDS البروتينات بشحنة سالبة تتناسب مع طولها، ففي مجال كهربائي تتحرك عبر شبكة البولي أكريلاميد حسب حجمها فقط. للهلام طبقتان: هلام تكديس قصير، منخفض pH والنسبة، يضغط كل عينة في حزمة رفيعة، وهلام فصل تحته يفصل البروتينات.

اختيار النسبة

• 8%: نحو 40 إلى 200 kDa
• 10%: نحو 20 إلى 150 kDa
• 12%: نحو 15 إلى 100 kDa، خيار عام شائع
• 15%: نحو 10 إلى 70 kDa

يكون هلام التكديس عادةً 4% أو 5%.

ما الذي يفعله كل مكوّن

• الأكريلاميد/bis: يكوّن شبكة الهلام؛ ونسبته تحدد حجم المسام.
• Tris-HCl: pH ‏8.8 عند 0.375 M في هلام الفصل وpH ‏6.8 عند 0.125 M في هلام التكديس. هذا الفرق في pH هو ما يكدّس العينات.
• SDS: بنسبة 0.1%، يبقي البروتينات مشوَّهة ومشحونة.
• APS وTEMED: يبدآن البلمرة. أضفهما أخيرًا، لأن الهلام يبدأ بالتصلب خلال دقائق.

صب الهلامين

1. ركّب الألواح الزجاجية وتحقق بالماء من عدم وجود تسرب.
2. امزج هلام الفصل، وأضف APS وTEMED، ورجّ واسكبه حتى 1.5 cm تحت المكان الذي ستصل إليه أسنان المشط.
3. غطّه بالأيزوبروبانول أو الماء ليبقى الحد مستويًا واتركه يتصلب من 20 إلى 30 دقيقة.
4. أزل طبقة التغطية، وامزج هلام التكديس مع APS وTEMED الخاصين به، واسكبه فوقه وضع المشط.
5. اتركه يتصلب، وانزع المشط واشطف الآبار.

الأكريلاميد غير المبلمر سام للأعصاب: البس القفازات وتعامل مع المحاليل بحذر.

الحاسبات

تعطي حاسبة هلام SDS-PAGE كل أحجام هلامي الفصل والتكديس لأي نسبة وعدد من الهلامات. ولتحميل الكمية نفسها من البروتين، قِس عيناتك بـ حاسبة تركيز البروتين (A280).