لماذا المنحنى القياسي
كثير من الاختبارات، مثل Bradford وBCA وELISA وqPCR، تعطي قراءة ترتفع مع التركيز، لكن ليس بمقدار ثابت ومعروف. قياس عينات معروفة التركيز في الوقت نفسه، أي المعايير، يبين كيف ترتبط القراءة بالتركيز في ذلك الاختبار، وتُقرأ العينات المجهولة على تلك العلاقة.
تحضير المعايير
- استخدم من 5 إلى 8 معايير تغطي المدى المتوقع، بما فيها صفر (عينة بيضاء).
- حضّرها في المحلول المنظِّم نفسه الذي فيه العينات، ليؤثر فيهما بالتساوي.
- حضّرها بالتخفيف من مخزون واحد وقِسها مكررة مرتين أو ثلاثًا بجانب العينات.
ملاءمة الخط
ارسم القراءة مقابل التركيز ولائم خطًا مستقيمًا، القراءة = الميل × التركيز + المقطع، بطريقة المربعات الصغرى. ثم لكل عينة:
التركيز = (القراءة − المقطع) ÷ الميل
اضرب في معامل التخفيف إن خففت العينة قبل قياسها.
مثال محلول
معايير BSA بتراكيز 0 و250 و500 و1000 µg/mL تعطي امتصاصيات 0.05 و0.37 و0.66 و1.21. الخط الملائم تقريبًا القراءة = 0.00115 × التركيز + 0.068. عينة مخففة 1:5 تقرأ 0.48: (0.48 − 0.068) ÷ 0.00115 = 358 µg/mL في البئر، أو نحو 1.8 mg/mL في العينة الأصلية.
تقييم المنحنى
- R² فوق 0.99 هو المعتاد. القيمة الأقل تشير إلى خطأ في السحب بالماصة أو قيمة شاذة.
- ابقَ ضمن المعايير. القراءات فوق أعلى معيار استقراء؛ خفّف العينة وأعد القياس.
- انتبه للانحناء. كثير من الاختبارات تتسطح عند التراكيز العالية. احذف المعايير العليا المنحرفة أو استخدم مدى أضيق.
الحاسبات
تلائم حاسبة المنحنى القياسي الخط، وتعطي R² وتحسب كل عينة مع تخفيفها. خطّط للمعايير بـ حاسبة التخفيفات المتسلسلة؛ وللبروتينات المنقاة، تستخدم حاسبة تركيز البروتين (A280) قراءة A280 بدلًا من منحنى.