الصيغة
تصل قليلات النيوكليوتيد جافة، مع الكمية بالـ nmol على الأنبوب أو في ورقة البيانات. لمخزون بوحدة µM:
الحجم المضاف (µL) = nmol × 1000 ÷ التركيز (µM)
للمخزون المعتاد 100 µM هو ببساطة nmol × 10: أنبوب فيه 25.4 nmol يأخذ 254 µL. وإن أعطت الورقة µg، فإن nmol = µg × 1000 ÷ الوزن الجزيئي.
خطوة بخطوة
- اطرد الأنبوب المغلق مركزيًا لفترة قصيرة ليبقى الراسب الجاف في القاع لا في الغطاء.
- أضف الحجم المحسوب من TE منخفض EDTA (Tris 10 mM، وEDTA 0.1 mM، وpH 8) أو من ماء خالٍ من النوكليازات.
- رجّ بالخلاط الدوامي، واتركه بضع دقائق في حرارة الغرفة، ثم رجّ مجددًا واطرده مركزيًا لفترة قصيرة.
تحضير محلول عمل
في PCR تُستخدم البادئات عادةً بتركيز 10 µM. من مخزون 100 µM هذا تخفيف 1:10: 10 µL من المخزون مع 90 µL من الماء أو TE تعطي 100 µL بتركيز 10 µM. واستخدام أنبوب عمل يغني عن سحب المخزون بالماصة مرة بعد مرة.
ماء أم TE؟
يحافظ TE على ثبات pH، والماء الحمضي قليلًا قد يتلف DNA ببطء، فتدوم المخزونات في TE مدة أطول. وكمية EDTA القليلة في TE منخفض EDTA لا تلتقط مغنيسيوم كافيًا للتأثير في PCR عند تخفيفات العمل. وبعض التطبيقات، مثل بعض تفاعلات التسلسل، تطلب الماء.
الحفظ
احفظ المخزونات عند −20 °C. قسّمها إلى عدة أجزاء حتى لا يكلفك أنبوب ملوث أو مذاب مرات كثيرة الطلبية كلها؛ تدوم قليلات النيوكليوتيد الجافة سنوات والمخزونات في TE أشهرًا كثيرة وهي مجمدة.
الحاسبات
تعطي حاسبة إعادة تعليق قليلات النيوكليوتيد الحجم لأي تركيز مخزون والمزيج لمحلول عمل. ويعطي تحليل بادئات PCR الوزن الجزيئي للبادئة، وتحل حاسبة التخفيف أي تخفيف آخر.
أحجام لمقاسات الأنابيب المعتادة
| الكمية في الأنبوب | لـ 100 µM | لـ 10 µM |
|---|---|---|
| 10 nmol | 100 µL | 1,000 µL |
| 25 nmol | 250 µL | 2,500 µL |
| 40 nmol | 400 µL | 4,000 µL |
| 100 nmol | 1,000 µL | 10,000 µL |
يذكر الموردون المردود بعد التخليق، وهو يختلف من أنبوب إلى آخر حتى في الطلبية نفسها، فاقرأ كل أنبوب بدل الاعتماد على المقياس المطلوب.
كم يدوم المخزون
تفاعل PCR بحجم 20 µL مع 0.2 µM من كل بادئ يحتاج 0.4 µL من محلول عمل بتركيز 10 µM. أنبوب 25 nmol بتركيز 100 µM، مخففًا إلى 10 µM، يكفي لآلاف التفاعلات، ولهذا يجري العمل اليومي بأنبوب العمل لا بالمخزون.
مشكلات شائعة
- بادئ جديد لا يعطي ناتجًا. تأكد من أنه أُعيد تعليقه: الأنبوب المفتوح قبل طرده مركزيًا قد يترك الراسب في الغطاء. أعد قراءة الـ nmol وتحقق من الحجم الذي أضفته.
- المخزون يقيس أقل بكثير من المتوقع في المطياف. استخدم معامل الانطفاء من ورقة البيانات، لا معاملًا عامًا. فامتصاص الأوليغو يعتمد كثيرًا على تسلسله.
- البادئات المذابة مرات كثيرة تتوقف عن العمل. دورات التجميد والتكثف تترك أثرها. اعمل بحصة واترك المخزون الرئيسي سليمًا.
- الأوليغوات الفلورية أو المعدّلة تخبو. احفظها في الظلام، وتجنب تجميدها مرارًا، واتبع ملاحظة التخزين من المورد، التي تختلف غالبًا عن الأوليغوات العادية.