PCR シミュレーター
このシミュレーションの式
| N₀ | 鋳型の初期コピー数 (10 のべき乗) | 最初の 2 本鎖コピー数 | |
|---|---|---|---|
| E | 効率 E (1 サイクルでコピーされる鋳型の割合)、% | よい反応では 90〜100%。ここでは T_a がプライマーの Tm に近すぎるとき、また反応でプライマーとヌクレオチドが尽きてくると下がる | |
| n | サイクル番号 | 各サイクル: 95 °C で変性、T_a でアニーリング、72 °C で伸長 | |
| N_n | n サイクル後の 2 本鎖コピー数 | 約 10¹² コピーで頭打ち: プラトー |
現在の値を入れると：
| 目的産物 | ちょうどアンプリコンの長さの産物 | 最初にできるのはサイクル 3。それまでは新しい鎖がプライマー部位を越えて伸び (長い産物)、その数は 1 サイクルに 2 ずつしか増えないので、すぐに目的産物のほうが多くなる | |
|---|---|---|---|
| 長い産物 | アンプリコンより長い鎖を含むコピー | プライマー部位を越えて伸びた鎖からできる。画像の下の数は分子の種類ごとに正確に数えている |
現在の値を入れると：
| Tm | 各プライマーの融解温度 | 14 塩基以上のプライマー用の基本式。プライマー Tm 計算ツールはより正確な最近接塩基対法の値を出す | |
|---|---|---|---|
| T_a | アニーリング温度 T_a (°C) | ふつうは低いほうの Tm より 3〜5 °C 低くする。高すぎるとプライマーが結合したままにならず、低すぎると間違った場所に結合する | |
| f_b | アニールするプライマーの割合 | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1.5))、プライマーの簡単な融解曲線 |
現在の値を入れると：
| L | アンプリコン長 | 塩基対単位、プライマーを含む |
|---|
現在の値を入れると：
PCR シミュレーターの使い方
- 鋳型と 2 本のプライマーを貼り付けます。どちらも 5′ から 3′ の向きで書き、フォワードプライマーは鋳型に現れるとおりに、リバースプライマーはもう一方の鎖に現れるとおりに書きます。シミュレーターは結合する位置、アンプリコン長、各プライマーの Tm を求めます。プライマーの組をさらに詳しく確かめるにはプライマー Tm 計算を使ってください。
- 各サイクルを拡大図で見ます。95 °C で 2 本の鎖が離れ、アニーリング温度でプライマーが結合部位に付き、72 °C でポリメラーゼがそれぞれから新しい鎖を伸ばします。その下ではチューブがコピーで満ちていきます。灰色は元の鎖を含むもの、青はプライマー部位を越えて伸びた長い産物、緑はちょうどの長さの目的アンプリコンです。
- アニーリング温度、効率、初期コピー数を設定し、各サイクル後に産物の種類ごとの正確な数を読みます。グラフはコピー数を対数目盛りで示し、増幅は直線となってプラトーへ曲がっていきます。ある質量の DNA が何コピーにあたるかは、DNA コピー数の計算とそのガイドで求められます。
よくある質問
PCR ではコピーがいくつできる？
各サイクルで DNA は最大 2 倍になるので、n サイクルで鋳型 1 つあたり最大 2ⁿ コピー、30 サイクルで約 10 億になります。実際の反応の効率は 90〜100% で、N = N₀ (1 + E)ⁿ となり、プライマーとヌクレオチドがなくなると約 10¹² コピーで頭打ちになります。
最初の産物が目的より長いのはなぜ？
最初のサイクルでは、ポリメラーゼに止まる合図がないので、各プライマーは元の鎖を結合部位から鋳型の端までコピーします。こうしてできた新しい鎖はもう一方のプライマーの部位で終わっており、そこにプライマーが結合して初めて、ちょうど目的の長さの鎖ができます。最初の 2 本鎖の目的分子はサイクル 3 で現れ、30 サイクル後にはほぼすべての産物が目的産物になります。鋳型 1 つあたり 2ⁿ − 2n に対し、長い産物は 2n です。
アニーリング温度はどう選ぶ？
2 本のプライマーのうち低いほうの Tm より 3〜5 °C 低いところから始めます。高すぎるとプライマーが結合したままにならず、シミュレーターが示すように効率が落ち込みます。低すぎると一部しか合わない場所にも結合し、ゲルに余分なバンドが出ます。いくつかの温度で行うグラジエント PCR で最適な温度が見つかります。
qPCR の Ct とは？
定量 PCR では蛍光色素が DNA のでき方を知らせ、Ct はシグナルが決めた閾値、グラフの破線のような線を超えたサイクルです。初期鋳型が 10 倍多いとおよそ 3.3 サイクル早く超えるので、qPCR はこうして最初の量を測ります。ΔΔCt 計算は Ct 値を発現量の倍率変化に変えます。
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