PCR सिम्युलेटर
इस सिमुलेशन के समीकरण
| N₀ | टेम्पलेट की शुरुआती प्रतियाँ (10 की घात के रूप में) | शुरुआत में दोहरे स्ट्रैंड वाली प्रतियाँ | |
|---|---|---|---|
| E | दक्षता E (हर चक्र में कॉपी हुए टेम्पलेट का हिस्सा), % | अच्छी अभिक्रिया में 90 से 100%; यहाँ तब घटती है जब T_a प्राइमरों के Tm के बहुत पास हो, और जब अभिक्रिया में प्राइमर और न्यूक्लियोटाइड खत्म होने लगें | |
| n | चक्र संख्या | हर चक्र: 95 °C पर विकृतीकरण, T_a पर एनीलिंग, 72 °C पर विस्तार | |
| N_n | n चक्रों के बाद दोहरे स्ट्रैंड वाली प्रतियाँ | लगभग 10¹² प्रतियों पर स्थिर हो जाती हैं: पठार |
मौजूदा मानों के साथ:
| लक्ष्य प्रतियाँ | ठीक एम्प्लिकॉन लंबाई वाले उत्पाद | पहले चक्र 3 में बनते हैं; तब तक नए स्ट्रैंड प्राइमर स्थलों से आगे निकल जाते हैं (लंबे उत्पाद), और उनकी संख्या हर चक्र में सिर्फ़ 2 बढ़ती है, इसलिए लक्ष्य जल्द ही उनसे कहीं ज़्यादा हो जाता है | |
|---|---|---|---|
| लंबे उत्पाद | एम्प्लिकॉन से लंबे स्ट्रैंड वाली प्रतियाँ | उन स्ट्रैंड से बनती हैं जो प्राइमर स्थल से आगे जाते हैं; चित्र के नीचे की गिनती हर तरह के अणु को ठीक-ठीक गिनती है |
मौजूदा मानों के साथ:
| Tm | हर प्राइमर का गलन तापमान | 14 या अधिक बेस वाले प्राइमर का मूल सूत्र; प्राइमर Tm कैलकुलेटर निकटतम-पड़ोसी विधि से अधिक सटीक मान देता है | |
|---|---|---|---|
| T_a | एनीलिंग तापमान T_a (°C) | आमतौर पर कम Tm से 3 से 5 °C नीचे; बहुत अधिक हो तो प्राइमर जुड़े नहीं रहते, बहुत कम हो तो गलत जगहों पर जुड़ते हैं | |
| f_b | जुड़ने वाले प्राइमरों का हिस्सा | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1.5)), प्राइमर का एक सरल गलन वक्र |
मौजूदा मानों के साथ:
| L | एम्प्लिकॉन लंबाई | बेस पेयर में, प्राइमर सहित |
|---|
मौजूदा मानों के साथ:
PCR सिम्युलेटर का उपयोग कैसे करें
- एक टेम्पलेट और दो प्राइमर चिपकाएँ, दोनों 5′ से 3′ लिखे हुए: फ़ॉरवर्ड प्राइमर जैसा टेम्पलेट में है, रिवर्स प्राइमर जैसा दूसरे स्ट्रैंड पर है। सिम्युलेटर बताता है कि वे कहाँ जुड़ते हैं, एम्प्लिकॉन की लंबाई और हर प्राइमर का Tm; प्राइमर जोड़ी को और बारीकी से प्राइमर Tm कैलकुलेटर में जाँचें।
- हर चक्र को नज़दीकी दृश्य में देखें: 95 °C पर दोनों स्ट्रैंड अलग होते हैं, एनीलिंग तापमान पर प्राइमर अपने स्थलों पर जुड़ते हैं, और 72 °C पर पॉलीमरेज़ हर एक से नया स्ट्रैंड बढ़ाता है। नीचे ट्यूब प्रतियों से भरती है: धूसर वे जिनमें मूल स्ट्रैंड है, नीले लंबे उत्पाद जो प्राइमर स्थलों से आगे जाते हैं, हरे ठीक लंबाई वाले लक्ष्य एम्प्लिकॉन।
- एनीलिंग तापमान, दक्षता और शुरुआती प्रतियों की संख्या सेट करें, और हर चक्र के बाद हर तरह के उत्पाद की सटीक गिनती पढ़ें। चार्ट प्रतियों को log पैमाने पर दिखाता है, जहाँ प्रवर्धन एक सीधी रेखा है जो पठार में मुड़ जाती है। DNA के किसी द्रव्यमान में कितनी प्रतियाँ हैं, यह जानने के लिए DNA प्रति संख्या कैलकुलेटर और उसकी गाइड देखें।
अक्सर पूछे जाने वाले सवाल
PCR कितनी प्रतियाँ बनाता है?
हर चक्र DNA को अधिक से अधिक दोगुना कर सकता है, इसलिए n चक्र प्रति टेम्पलेट 2ⁿ तक प्रतियाँ देते हैं: 30 चक्रों के बाद लगभग एक अरब। असली अभिक्रियाएँ 90 से 100% दक्षता पर चलती हैं, N = N₀ (1 + E)ⁿ, और प्राइमर व न्यूक्लियोटाइड खत्म होने पर लगभग 10¹² प्रतियों पर स्थिर हो जाती हैं।
पहले उत्पाद लक्ष्य से लंबे क्यों होते हैं?
पहले चक्र में हर प्राइमर मूल स्ट्रैंड को अपने स्थल से टेम्पलेट के अंत तक कॉपी करता है, क्योंकि पॉलीमरेज़ को रुकने के लिए कुछ नहीं कहता। जब कोई प्राइमर इन नए स्ट्रैंड में से किसी से जुड़ता है, जो दूसरे प्राइमर के स्थल पर खत्म होता है, तभी ठीक लक्ष्य लंबाई का स्ट्रैंड बनता है। पहले दोहरे स्ट्रैंड वाले लक्ष्य अणु चक्र 3 में आते हैं, और 30 चक्रों के बाद लगभग सारे उत्पाद यही होते हैं: प्रति टेम्पलेट 2ⁿ − 2n, जबकि लंबे उत्पाद सिर्फ़ 2n।
एनीलिंग तापमान कैसे चुनें?
दोनों प्राइमरों के कम Tm से 3 से 5 °C नीचे से शुरू करें। बहुत गर्म हो तो प्राइमर जुड़े नहीं रहते, इसलिए दक्षता गिर जाती है, जैसा सिम्युलेटर दिखाता है; बहुत ठंडा हो तो वे आंशिक रूप से मेल खाने वाली जगहों पर भी जुड़ते हैं, जिससे जेल पर अतिरिक्त बैंड आते हैं। कई तापमानों पर ग्रेडिएंट PCR सबसे अच्छा तापमान ढूँढती है।
qPCR में Ct क्या है?
मात्रात्मक PCR में एक प्रतिदीप्त रंजक DNA बनते समय उसकी सूचना देता है, और Ct वह चक्र है जिस पर संकेत एक तय देहली पार करता है, जैसे चार्ट की टूटी रेखा। दस गुना ज़्यादा शुरुआती टेम्पलेट इसे लगभग 3.3 चक्र पहले पार करता है, और इसी तरह qPCR मापता है कि कितना था। ΔΔCt कैलकुलेटर Ct मानों को गुना बदलाव में बदलता है।
यह कहता है कि WebGL बंद है।
3D दृश्य के लिए WebGL चाहिए, जो हर आधुनिक ब्राउज़र में होता है। ब्राउज़र सेटिंग में हार्डवेयर एक्सेलरेशन बंद होने या बहुत पुराने ग्राफ़िक्स ड्राइवर से यह बंद हो सकता है। हार्डवेयर एक्सेलरेशन चालू करें या दूसरा ब्राउज़र आज़माएँ।
क्या कुछ अपलोड होता है?
नहीं। सिमुलेशन आपका अपना ब्राउज़र WebGL से बनाता है; कहीं कुछ नहीं भेजा जाता, और पेज लोड होने के बाद यह ऑफ़लाइन भी चलता रहता है।