Simulator PCR
Persamaan dalam simulasi ini
| N₀ | Salinan awal cetakan (sebagai pangkat 10) | salinan untai ganda di awal | |
|---|---|---|---|
| E | Efisiensi E (bagian cetakan yang disalin tiap siklus), % | 90 sampai 100% pada reaksi yang baik; di sini turun bila T_a terlalu dekat dengan Tm primer dan saat reaksi kehabisan primer dan nukleotida | |
| n | nomor siklus | tiap siklus: denaturasi pada 95 °C, annealing pada T_a, ekstensi pada 72 °C | |
| N_n | salinan untai ganda setelah n siklus | mendatar di sekitar 10¹² salinan: plateau |
Dengan nilai saat ini:
| salinan target | produk dengan panjang tepat amplikon | yang pertama muncul di siklus 3; sampai saat itu untai baru melewati situs primer (produk panjang), dan jumlahnya hanya bertambah 2 per siklus, jadi target segera melampauinya | |
|---|---|---|---|
| produk panjang | salinan dengan untai yang lebih panjang dari amplikon | berasal dari untai yang melewati situs primer; hitungan di bawah gambar mengikuti setiap jenis molekul dengan tepat |
Dengan nilai saat ini:
| Tm | suhu leleh tiap primer | rumus dasar untuk primer 14 basa atau lebih; Kalkulator Tm Primer memberi nilai tetangga terdekat yang lebih akurat | |
|---|---|---|---|
| T_a | Suhu annealing T_a (°C) | biasanya 3 sampai 5 °C di bawah Tm yang lebih rendah; jauh lebih tinggi dan primer tidak tetap menempel, jauh lebih rendah dan primer menempel di tempat yang salah | |
| f_b | bagian primer yang menempel | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), kurva leleh sederhana untuk primer |
Dengan nilai saat ini:
| L | panjang amplikon | dalam pasangan basa, termasuk primer |
|---|
Dengan nilai saat ini:
Cara memakai simulator PCR
- Tempelkan cetakan dan dua primer, keduanya ditulis 5′ ke 3′: primer maju sebagaimana tertulis di cetakan, primer mundur sebagaimana tertulis di untai lainnya. Simulator menemukan tempat primer menempel, panjang amplikon dan Tm tiap primer; periksa pasangan primer lebih rinci dengan Kalkulator Tm Primer.
- Ikuti tiap siklus pada tampilan dekat: pada 95 °C kedua untai terpisah, pada suhu annealing primer menempel di situsnya, dan pada 72 °C polimerase memperpanjang untai baru dari masing-masing. Di bawahnya, tabung terisi salinan: abu-abu yang masih punya untai asli, biru produk panjang yang melewati situs primer, hijau amplikon target dengan panjang yang tepat.
- Atur suhu annealing, efisiensi dan jumlah salinan awal, lalu baca jumlah pasti tiap jenis produk setelah setiap siklus. Grafik menampilkan salinan dalam skala log, tempat amplifikasi berupa garis lurus yang melengkung ke plateau. Untuk tahu berapa salinan dalam massa DNA tertentu, pakai Kalkulator Jumlah Salinan DNA dan panduannya.
Pertanyaan umum
Berapa banyak salinan yang dibuat PCR?
Tiap siklus paling banyak menggandakan DNA, jadi n siklus memberi hingga 2ⁿ salinan per cetakan: sekitar satu miliar setelah 30 siklus. Reaksi nyata berjalan dengan efisiensi 90 sampai 100%, N = N₀ (1 + E)ⁿ, dan mendatar di sekitar 10¹² salinan saat primer dan nukleotida habis.
Mengapa produk pertama lebih panjang dari target?
Pada siklus pertama, tiap primer menyalin untai asli dari situsnya sampai ujung cetakan, karena tidak ada yang menyuruh polimerase berhenti. Baru saat primer menempel pada salah satu untai baru itu, yang berakhir di situs primer lainnya, terbentuk untai dengan panjang target yang tepat. Molekul target untai ganda pertama muncul di siklus 3, dan setelah 30 siklus hampir semua produk adalah target: 2ⁿ − 2n per cetakan, dibanding 2n produk panjang.
Bagaimana memilih suhu annealing?
Mulailah 3 sampai 5 °C di bawah Tm yang lebih rendah dari kedua primer. Terlalu panas dan primer tidak tetap menempel, sehingga efisiensi anjlok, seperti yang ditunjukkan simulator; terlalu dingin dan primer juga menempel di tempat yang hanya cocok sebagian, sehingga muncul pita tambahan di gel. PCR gradien pada beberapa suhu menemukan yang terbaik.
Apa itu Ct pada qPCR?
Pada PCR kuantitatif, pewarna fluoresen melaporkan DNA saat dibuat, dan Ct adalah siklus ketika sinyal melewati ambang yang ditetapkan, seperti garis putus-putus pada grafik. Setiap cetakan awal sepuluh kali lebih banyak melewatinya sekitar 3,3 siklus lebih awal, begitulah qPCR mengukur berapa banyak yang ada. Kalkulator ΔΔCt mengubah nilai Ct menjadi perubahan lipat.
Katanya WebGL dimatikan.
Tampilan 3D memerlukan WebGL, yang dimiliki semua browser terkini. WebGL bisa nonaktif jika akselerasi perangkat keras dimatikan di pengaturan browser, atau karena driver grafis yang sangat lama. Nyalakan akselerasi perangkat keras, atau coba browser lain.
Apakah ada yang diunggah?
Tidak. Simulasi digambar oleh browser Anda sendiri dengan WebGL; tidak ada yang dikirim ke mana pun, dan simulasi tetap berjalan offline setelah halaman dimuat.