Simulador de PCR
Equações desta simulação
| N₀ | Cópias iniciais do molde (como potência de 10) | cópias de fita dupla no início | |
|---|---|---|---|
| E | Eficiência E (fração dos moldes copiada a cada ciclo), % | 90 a 100% numa boa reação; aqui diminui quando T_a fica perto demais da Tm dos primers e quando a reação fica sem primers e nucleotídeos | |
| n | número do ciclo | cada ciclo: desnaturar a 95 °C, anelar a T_a, estender a 72 °C | |
| N_n | cópias de fita dupla após n ciclos | se estabiliza perto de 10¹² cópias: o platô |
Com os valores atuais:
| cópias do alvo | produtos com o comprimento exato do amplicon | as primeiras aparecem no ciclo 3; até lá as fitas novas passam dos sítios dos primers (produtos longos), e o número delas só cresce 2 por ciclo, então o alvo logo as supera | |
|---|---|---|---|
| produtos longos | cópias com uma fita mais longa que o amplicon | vêm de fitas que passam do sítio de um primer; as contagens abaixo da imagem acompanham cada tipo de molécula exatamente |
Com os valores atuais:
| Tm | temperatura de melting de cada primer | a fórmula básica para primers de 14 bases ou mais; a Calculadora de Tm de primers tem o valor mais preciso de vizinhos mais próximos | |
|---|---|---|---|
| T_a | Temperatura de anelamento T_a (°C) | em geral 3 a 5 °C abaixo da Tm mais baixa; bem mais alta e os primers não ficam ligados, bem mais baixa e eles se ligam nos lugares errados | |
| f_b | fração dos primers que anelam | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), uma curva de melting simples para o primer |
Com os valores atuais:
| L | comprimento do amplicon | em pares de bases, primers incluídos |
|---|
Com os valores atuais:
Como usar o simulador de PCR
- Cole um molde e dois primers, ambos escritos de 5′ para 3′: o primer direto como aparece no molde e o reverso como aparece na outra fita. O simulador encontra onde eles se ligam, o comprimento do amplicon e a Tm de cada primer; confira um par de primers com mais detalhe na Calculadora de Tm de primers.
- Acompanhe cada ciclo no close: a 95 °C as duas fitas se separam, na temperatura de anelamento os primers se ligam aos seus sítios e a 72 °C a polimerase estende uma fita nova a partir de cada um. Embaixo, o tubo se enche de cópias: cinza as que têm uma fita original, azuis os produtos longos que passam dos sítios dos primers, verdes os amplicons-alvo do tamanho exato.
- Ajuste a temperatura de anelamento, a eficiência e o número de cópias iniciais, e leia após cada ciclo a contagem exata de cada tipo de produto. O gráfico mostra as cópias em escala logarítmica, onde a amplificação é uma reta que se curva até o platô. Para saber quantas cópias há numa dada massa de DNA, use a Calculadora de número de cópias de DNA e o seu guia.
Perguntas frequentes
Quantas cópias uma PCR faz?
Cada ciclo pode no máximo dobrar o DNA, então n ciclos dão até 2ⁿ cópias por molde: cerca de um bilhão após 30 ciclos. Reações reais rodam com 90 a 100% de eficiência, N = N₀ (1 + E)ⁿ, e se estabilizam perto de 10¹² cópias quando os primers e os nucleotídeos acabam.
Por que os primeiros produtos são mais longos que o alvo?
No primeiro ciclo cada primer copia a fita original do seu sítio até o fim do molde, porque nada diz à polimerase para parar. Só quando um primer se liga a uma dessas fitas novas, que termina no sítio do outro primer, sai uma fita com o comprimento exato do alvo. As primeiras moléculas-alvo de fita dupla aparecem no ciclo 3, e após 30 ciclos elas são quase todos os produtos: 2ⁿ − 2n por molde, contra 2n produtos longos.
Como escolho a temperatura de anelamento?
Comece 3 a 5 °C abaixo da Tm mais baixa dos dois primers. Quente demais e os primers não ficam ligados, então a eficiência despenca, como o simulador mostra; fria demais e eles se ligam também em lugares que combinam só em parte, dando bandas extras no gel. Uma PCR em gradiente em várias temperaturas encontra a melhor.
O que é o Ct na qPCR?
Na PCR quantitativa um corante fluorescente indica o DNA à medida que ele é feito, e o Ct é o ciclo em que o sinal cruza um limiar fixo, como a linha tracejada do gráfico. Cada molde dez vezes maior cruza cerca de 3,3 ciclos antes, e é assim que a qPCR mede quanto havia. A Calculadora ΔΔCt transforma valores de Ct em variações de expressão.
Diz que o WebGL está desativado.
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Alguma coisa é enviada?
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