Simulador de eletroforese em gel
Equações desta simulação
| V | Tensão V (volts) | o DNA tem carga negativa, então corre do eletrodo preto (−) para o vermelho (+) | |
|---|---|---|---|
| d | distância entre os eletrodos | 15 cm nesta cuba; o que importa é o campo E, então uma cuba mais longa precisa de mais volts | |
| E | campo elétrico | cerca de 5 a 8 V/cm numa corrida normal | |
| v | velocidade de uma banda | em cm por hora |
Com os valores atuais:
| μ₀ | mobilidade do DNA em solução livre | 3 × 10⁻⁴ cm²/(V·s), igual para qualquer comprimento porque a carga e o atrito crescem ambos com o comprimento | |
|---|---|---|---|
| L | comprimento do fragmento (pb) | o gel é uma peneira: fragmentos longos são mais retidos | |
| T | Agarose T (% m/v) | um gel mais denso tem poros menores, separa melhor os fragmentos pequenos e pior os grandes | |
| L* | o comprimento em que o gel reduz a velocidade à metade | um ajuste empírico; acima de uns 20 kb num gel a 1 % todo fragmento corre à mesma velocidade limite e eles se acumulam numa banda |
Com os valores atuais:
| a, b | a curva padrão | uma reta ajustada às bandas do marcador; ler nela uma banda desconhecida dá o seu tamanho | |
|---|---|---|---|
| R² | quão bem a reta se ajusta | cai quando bandas do marcador perto do topo ou da base saem da faixa que o gel separa bem |
Com os valores atuais:
| σ | largura de uma banda | a banda começa tão larga quanto o poço e se alarga por difusão; uma corrida longa e lenta dá bandas mais difusas, e o aquecimento Joule acima de uns 10 V/cm as borra ainda mais |
|---|
Com os valores atuais:
| R | resistência do tampão | cerca de 1,6 kΩ para um minigel em TAE 1× | |
|---|---|---|---|
| P | potência de aquecimento | aquece o gel e o tampão: em excesso, o gel sorri (as canaletas do meio se adiantam) ou derrete |
Com os valores atuais:
Como usar o simulador de eletroforese em gel
- A canaleta 1 tem um marcador de tamanhos conhecidos, a 2 um plasmídeo não cortado, a 3 o plasmídeo cortado uma vez, a 4 o plasmídeo cortado com duas enzimas, a 5 um produto de PCR e a 6 os tamanhos que você digitar. O gel começa a correr na hora: o DNA vai do eletrodo preto para o vermelho, com os corantes azuis de carregamento à frente.
- Acompanhe o tempo de corrida e a frente do corante, e pare quando o azul de bromofenol tiver percorrido cerca de três quartos do caminho, antes que fragmentos pequenos saiam pelo fim. Mude a porcentagem de agarose para ver um gel denso separar fragmentos pequenos e um diluído separar os grandes; aumente a tensão para correr mais rápido e, acima de cerca de 10 V/cm, veja as bandas borrarem e sorrirem quando o gel esquenta.
- Leia os tamanhos das bandas abaixo da imagem: a simulação ajusta uma reta de log do tamanho contra a distância às bandas do marcador e lê nela cada banda, com um ponto de interrogação quando a banda fica fora do marcador. O gráfico mostra essa curva padrão. Para preparar o gel use a Calculadora de gel de agarose; para estimar bandas de um gel real, Estimar o tamanho de banda em gel.
Perguntas frequentes
Por que o DNA se move pelo gel?
Seu esqueleto de fosfatos tem uma carga negativa por base, então num campo elétrico o DNA se move para o eletrodo positivo. Em solução livre a carga e o arrasto crescem ambos com o comprimento, então todos os fragmentos andariam na mesma velocidade; quem os separa é a malha de agarose, que segura mais as moléculas longas do que as curtas.
Por que o plasmídeo não cortado dá mais de uma banda?
Um plasmídeo recém-tirado da célula está quase todo superenovelado, torcido sobre si mesmo, o que o deixa compacto e o faz correr à frente de um DNA linear do mesmo comprimento. Plasmídeos com uma quebra numa fita relaxam num círculo aberto que se arrasta pelo gel e fica para trás. Cortado uma vez, o plasmídeo vira uma única banda linear no seu comprimento real.
Que porcentagem de agarose devo usar?
Cerca de 0,7 % para fragmentos de 5 a 20 kb, 1 % para 0,5 a 10 kb, 1,5 % para 0,2 a 3 kb e 2 a 3 % para 50 pb a 1 kb. Num gel diluído os fragmentos pequenos correm juntos, e num denso os grandes mal entram. Acima de cerca de 20 kb todos os fragmentos num gel comum andam na mesma velocidade limite e se acumulam numa banda; para eles se usa a eletroforese em campo pulsado.
Qual a precisão de ler o tamanho de uma banda pelo marcador?
De 5 a 10 % quando a banda fica entre bandas do marcador no meio do gel, onde o log do tamanho cai quase em linha reta com a distância. Piora perto do topo e da base do gel e fora da faixa do marcador, e plasmídeo superenovelado ou cortado numa fita não pode ser medido com um marcador linear.
Diz que o WebGL está desativado.
A visualização 3D precisa de WebGL, que todo navegador atual tem. Ele pode ser desativado pela aceleração de hardware desligada nas configurações do navegador, ou por um driver gráfico muito antigo. Ligue a aceleração de hardware ou tente outro navegador.
Alguma coisa é enviada?
Não. A simulação é desenhada pelo seu próprio navegador com WebGL; nada é enviado a lugar nenhum, e ela continua funcionando offline depois que a página carrega.