ゲル電気泳動シミュレーター
このシミュレーションの式
| V | 電圧 V (ボルト) | DNA は負に帯電しているので、黒い電極 (−) から赤い電極 (+) へ泳動する | |
|---|---|---|---|
| d | 電極間の距離 | この泳動槽では 15 cm; 効くのは電場 E なので、長い泳動槽ほど高い電圧が必要 | |
| E | 電場 | 標準的な泳動で約 5〜8 V/cm | |
| v | バンドの速さ | 1 時間あたりの cm |
現在の値を入れると：
| μ₀ | 自由溶液中の DNA の移動度 | 3 × 10⁻⁴ cm²/(V·s)、電荷も摩擦も長さとともに増えるので、どの長さでも同じ | |
|---|---|---|---|
| L | 断片の長さ (bp) | ゲルはふるい: 長い断片ほど引き止められる | |
| T | アガロース T (% w/v) | 濃いゲルは孔が小さく、小さな断片をよく分け、大きな断片の分離は悪くなる | |
| L* | ゲルで速さが半分になる長さ | 経験的な近似式; 1% ゲルでは約 20 kb を超えるとどの断片も同じ限界速度で泳動し、1 本のバンドに重なる |
現在の値を入れると：
| a, b | 検量線 | ラダーのバンドに当てはめた直線; 未知のバンドをこれで読むとサイズがわかる | |
|---|---|---|---|
| R² | 直線の当てはまりのよさ | 上端や下端に近いラダーのバンドが、ゲルがよく分離できる範囲から外れると下がる |
現在の値を入れると：
| σ | バンドの幅 | バンドはウェルと同じ幅で始まり、拡散で広がる; 長くゆっくりした泳動ではバンドがぼやけ、約 10 V/cm を超えるとジュール熱でさらに広がる |
|---|
現在の値を入れると：
| R | バッファーの抵抗 | 1× TAE のミニゲルで約 1.6 kΩ | |
|---|---|---|---|
| P | 発熱 | ゲルとバッファーを温める: 多すぎるとゲルがスマイル (中央のレーンが先行) したり、溶けたりする |
現在の値を入れると：
ゲル電気泳動シミュレーターの使い方
- レーン 1 にはサイズが既知のラダー、レーン 2 には未切断のプラスミド、レーン 3 には 1 か所で切断したプラスミド、レーン 4 には 2 種類の酵素で切断したプラスミド、レーン 5 には PCR 産物、レーン 6 には入力した任意のサイズが入っています。泳動はすぐに始まり、DNA は黒い電極から赤い電極へ進み、青いローディング色素が先行します。
- 泳動時間と色素の先端を見て、ブロモフェノールブルーが全体の約 4 分の 3 まで進んだら、小さな断片が端から流れ出る前に止めてください。アガロース濃度を変えると、濃いゲルは小さな断片を、薄いゲルは大きな断片をよく分けることがわかります。電圧を上げると速く泳動でき、約 10 V/cm を超えるとゲルが熱くなってバンドがにじみ、スマイルするのが見えます。
- 画像の下でバンドサイズを読み取ります: シミュレーションはラダーのバンドに対数サイズと距離の直線を当てはめ、ほかの各バンドをその直線から読み取ります。ラダーの範囲外のバンドには疑問符が付きます。グラフはこの検量線です。ゲルを作るには アガロースゲルの計算、実際のゲルのバンドを見積もるには ゲルのバンドサイズ推定 を使ってください。
よくある質問
DNA はなぜゲルの中を移動するのですか?
DNA のリン酸骨格は塩基 1 つあたり 1 個の負電荷をもつので、電場の中で正の電極へ移動します。自由溶液中では電荷も摩擦も長さとともに増えるため、どの断片も同じ速さで進むはずです。断片を分けるのはアガロースの網目で、長い分子ほど強く引き止めます。
未切断のプラスミドはなぜ複数のバンドになるのですか?
細胞から取り出したばかりのプラスミドはほとんどがスーパーコイル、つまり自分自身にきつくねじれた形で、コンパクトなため同じ長さの直鎖状 DNA より速く泳動します。片方の鎖が切れたプラスミドはほどけて開環状になり、ゲルの中を引きずられるように遅れて進みます。1 か所で切断すると、プラスミドは本来の長さの 1 本の直鎖状バンドになります。
アガロース濃度はどれくらいにすればよいですか?
5〜20 kb の断片には約 0.7%、0.5〜10 kb には 1%、0.2〜3 kb には 1.5%、50 bp〜1 kb には 2〜3% が目安です。薄いゲルでは小さな断片がまとまって泳動し、濃いゲルでは大きな断片がほとんど入りません。約 20 kb を超えると、通常のゲルではすべての断片が同じ限界速度で進み、1 本のバンドに重なります。こうした断片にはパルスフィールドゲル電気泳動を使います。
ラダーからバンドサイズを読む精度はどれくらいですか?
バンドがゲルの中ほどでラダーのバンドの間にあれば約 5〜10% です。そこでは対数サイズが距離に対してほぼ直線的に下がります。ゲルの上端や下端の近く、ラダーの範囲外では精度が落ち、スーパーコイルやニックの入ったプラスミドは直鎖状のラダーでは測定できません。
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