Simulateur d'électrophorèse sur gel
Équations de cette simulation
| V | Tension V (volts) | l'ADN est chargé négativement, il migre donc de l'électrode noire (−) vers la rouge (+) | |
|---|---|---|---|
| d | distance entre les électrodes | 15 cm dans cette cuve ; c'est le champ E qui compte, une cuve plus longue demande donc plus de volts | |
| E | champ électrique | environ 5 à 8 V/cm pour une migration standard | |
| v | vitesse d'une bande | en cm par heure |
Avec les valeurs actuelles :
| μ₀ | mobilité de l'ADN en solution libre | 3 × 10⁻⁴ cm²/(V·s), la même pour toute longueur car la charge et le frottement croissent tous deux avec la longueur | |
|---|---|---|---|
| L | longueur du fragment (pb) | le gel est un tamis : les longs fragments sont davantage retenus | |
| T | Agarose T (% m/v) | un gel plus dense a des pores plus petits ; il sépare mieux les petits fragments et moins bien les grands | |
| L* | la longueur à laquelle le gel ralentit à mi-vitesse | un ajustement empirique ; au-delà d'environ 20 kb dans un gel à 1 %, tous les fragments migrent à la même vitesse limite et s'entassent en une bande |
Avec les valeurs actuelles :
| a, b | la courbe étalon | une droite ajustée aux bandes du marqueur ; y lire une bande inconnue donne sa taille | |
|---|---|---|---|
| R² | qualité de l'ajustement de la droite | il baisse quand des bandes du marqueur près du haut ou du bas sortent de la plage que le gel sépare bien |
Avec les valeurs actuelles :
| σ | largeur d'une bande | la bande part aussi large que le puits et s'élargit par diffusion ; une migration longue et lente donne des bandes plus floues, et l'échauffement Joule au-delà d'environ 10 V/cm les étale davantage |
|---|
Avec les valeurs actuelles :
| R | résistance du tampon | environ 1,6 kΩ pour un minigel en TAE 1× | |
|---|---|---|---|
| P | puissance de chauffage | chauffe le gel et le tampon : trop, et le gel sourit (les pistes du milieu avancent plus vite) ou fond |
Avec les valeurs actuelles :
Comment utiliser le simulateur d'électrophorèse sur gel
- La piste 1 contient un marqueur de tailles connues, la 2 un plasmide non coupé, la 3 le plasmide coupé une fois, la 4 le plasmide coupé par deux enzymes, la 5 un produit de PCR et la 6 les tailles que vous tapez. Le gel démarre aussitôt : l'ADN migre de l'électrode noire vers la rouge, les colorants de charge bleus en tête.
- Surveillez la durée et le front du colorant, et arrêtez quand le bleu de bromophénol a parcouru environ les trois quarts du gel, avant que les petits fragments ne sortent par le bout. Changez le pourcentage d'agarose : un gel dense sépare les petits fragments, un gel dilué les grands. Montez la tension pour aller plus vite et, au-delà d'environ 10 V/cm, voyez les bandes s'étaler et sourire quand le gel chauffe.
- Lisez les tailles sous l'image : la simulation ajuste une droite du log de la taille en fonction de la distance aux bandes du marqueur et y lit chaque autre bande, avec un point d'interrogation quand une bande sort de la gamme du marqueur. Le graphique montre cette courbe étalon. Pour couler le gel, utilisez le Calcul de gel d'agarose ; pour estimer les bandes d'un vrai gel, Estimer la taille d'une bande sur gel.
Questions fréquentes
Pourquoi l'ADN migre-t-il dans le gel ?
Son squelette de phosphates porte une charge négative par base, donc dans un champ électrique l'ADN se déplace vers l'électrode positive. En solution libre, la charge et le frottement croissent tous deux avec la longueur, si bien que tous les fragments iraient à la même vitesse ; c'est le maillage d'agarose qui les sépare, en retenant davantage les longues molécules que les courtes.
Pourquoi un plasmide non coupé donne-t-il plusieurs bandes ?
Un plasmide tout juste sorti de la cellule est surtout surenroulé, tordu sur lui-même, ce qui le rend compact et le fait migrer devant un ADN linéaire de même longueur. Les plasmides dont un brin est coupé se détendent en cercle ouvert qui se traîne dans le gel et reste derrière. Coupé une fois, le plasmide devient une seule bande linéaire à sa vraie longueur.
Quel pourcentage d'agarose choisir ?
Environ 0,7 % pour des fragments de 5 à 20 kb, 1 % pour 0,5 à 10 kb, 1,5 % pour 0,2 à 3 kb et 2 à 3 % pour 50 pb à 1 kb. Dans un gel dilué, les petits fragments migrent ensemble, et dans un gel dense les grands entrent à peine. Au-delà d'environ 20 kb, tous les fragments d'un gel ordinaire avancent à la même vitesse limite et s'entassent en une bande ; on utilise pour eux l'électrophorèse en champ pulsé.
Quelle est la précision de la lecture d'une taille avec le marqueur ?
Environ 5 à 10 % quand la bande se trouve entre des bandes du marqueur au milieu du gel, là où le log de la taille décroît presque en ligne droite avec la distance. Elle se dégrade près du haut et du bas du gel et hors de la gamme du marqueur, et un plasmide surenroulé ou coupé sur un brin ne peut pas du tout être mesuré avec un marqueur linéaire.
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Quelque chose est-il envoyé ?
Non. La simulation est dessinée par votre propre navigateur avec WebGL ; rien n'est envoyé nulle part, et elle continue de fonctionner hors ligne une fois la page chargée.