Comment fonctionne l'électrophorèse sur gel : lire un gel d'ADN et mesurer les bandes avec un marqueur

Ce qui fait avancer l'ADN

Chaque nucléotide de l'ADN porte une charge négative sur son phosphate : dans un champ électrique, l'ADN se déplace donc vers l'électrode positive (la rouge ; retenez « ça court vers le rouge »). En solution libre, la charge et le frottement croissent ensemble avec la longueur, si bien qu'un fragment de 100 pb et un de 10 000 pb iraient à la même vitesse. C'est le gel qui les sépare : l'agarose forme un maillage de pores, et les molécules les plus longues sont davantage freinées en s'y frayant un chemin.

Ce qui décide où finit une bande

La longueur du fragment. Dans la gamme utile d'un gel, la distance parcourue décroît à peu près en ligne droite avec le logarithme de la longueur. Doubler la taille recule une bande d'à peu près la même distance partout dans cette gamme.
Le pourcentage d'agarose. Un gel plus dense a des pores plus petits. En gros : 0,7 % pour 5 à 20 kb, 1 % pour 0,5 à 10 kb, 1,5 % pour 0,2 à 3 kb, 2 à 3 % pour 50 pb à 1 kb.
L'intensité du champ. La vitesse est proportionnelle aux volts par centimètre entre les électrodes, non à la tension elle-même. On travaille d'habitude à 5 à 8 V/cm ; un minigel dans une cuve aux électrodes distantes de 15 cm migre à environ 100 V.
La forme. Un plasmide surenroulé est compact et migre devant l'ADN linéaire de même longueur ; un plasmide coupé sur un brin (cercle ouvert) se traîne et reste derrière ; l'ARN et les simples brins se replient et migrent de façon imprévisible.
Le tampon et le colorant. Le TAE sépare un peu mieux les grands fragments, le TBE les petits. Le bromure d'éthidium ralentit légèrement l'ADN, et les colorants de charge migrent avec des fragments d'une taille qui dépend du gel : le bleu de bromophénol avec environ 300 à 500 pb dans un gel à 1 %, le xylène cyanol avec environ 3 à 4 kb.

Mesurer une bande avec le marqueur

Un marqueur est un mélange de fragments de taille connue qui migre dans sa propre piste. Mesurez la distance du puits à chaque bande du marqueur, tracez log₁₀(taille) en fonction de la distance et ajustez une droite : la courbe étalon. Lisez-y la taille d'une bande inconnue.

Exemple : dans un gel à 1 %, la bande de 3 000 pb du marqueur a parcouru 2,6 cm et celle de 1 000 pb 4,0 cm. La droite qui les relie a une pente de (log₁₀ 1 000 − log₁₀ 3 000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 par cm. Une bande inconnue à 3,3 cm est à log₁₀(taille) = log₁₀ 3 000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, sa taille est donc 10^3,238 ≈ 1 730 pb. Utilisez les deux bandes du marqueur qui encadrent l'inconnue, ou une droite ajustée sur plusieurs, et ne lisez pas au-delà de la dernière bande du marqueur.

Lire les résultats courants

Plasmide non coupé : deux ou trois bandes, la surenroulée en bas, la coupée sur un brin en haut et parfois la linéaire entre les deux. Aucune n'est à la vraie taille du plasmide sur un marqueur linéaire.
Plasmide linéarisé (une coupure) : une bande à la longueur totale, bonne preuve qu'une seule enzyme a coupé.
Double digestion : des fragments dont la somme devrait égaler la taille du plasmide. Sinon, un petit fragment est peut-être sorti du gel ou trop pâle, ou deux fragments de taille voisine se trouvent dans une même bande.
Produit de PCR : une bande nette à la taille attendue. Une traînée signale trop de matrice ou trop de cycles ; des bandes en plus, des amorces qui s'hybrident au mauvais endroit ; une bande floue tout en bas, des dimères d'amorces.

Utiliser la simulation

Dans le Simulateur d'électrophorèse sur gel, les pistes 1 à 6 contiennent un marqueur, un plasmide non coupé, le plasmide coupé une et deux fois, un produit de PCR et les tailles que vous tapez. La migration démarre aussitôt. Arrêtez quand le front du bleu de bromophénol a parcouru environ les trois quarts du gel, puis lisez les tailles sous l'image, chacune estimée par une droite ajustée sur les bandes du marqueur encore dans le gel. À essayer :

Mettez la piste 6 à 100, 150, 200 et faites migrer un gel à 1 % : les trois migrent ensemble, juste devant le front du colorant. Recommencez à 2,5 % et elles se séparent.
Mettez la piste 6 à 20000, 30000, 48000 dans un gel à 1 % : elles s'entassent en une bande, la mobilité limite.
Montez la tension à 250 V : la migration est rapide, mais les bandes s'étalent et les pistes du milieu devancent celles des bords (le sourire) quand le gel chauffe.
Laissez la migration continuer : les petits fragments et le colorant sortent par le bout et sont perdus.

Ce que le modèle suppose

Une formule empirique de mobilité, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) avec L* = 2 000 pb × (1 % ÷ T)^1,4, choisie pour donner des positions réalistes pour 0,5 à 3 % d'agarose en TAE. C'est un ajustement, pas une théorie de la migration de l'ADN dans les pores, et ses valeurs sont typiques, non exactes pour une marque d'agarose donnée.
Une mobilité limite pour l'ADN très long, en dessous de laquelle aucun fragment ne ralentit davantage ; dans un gel à 1 %, elle est atteinte vers 20 kb.
Des facteurs de forme fixes pour les plasmides : l'ADN surenroulé migre comme un ADN linéaire de 0,6 fois sa longueur, le coupé sur un brin comme un de 1,8 fois. En réalité, ces facteurs changent avec le pourcentage du gel, la tension, le degré de surenroulement et la présence de bromure d'éthidium dans le gel.
Des quantités égales de chaque fragment dans une digestion (équimolaires), si bien que l'intensité d'une bande est proportionnelle à sa longueur, et 300 ng d'ADN par piste d'échantillon. Une bande a besoin d'environ 2 ng pour être visible.
Un champ et une température uniformes dans tout le gel, 15 cm entre les électrodes et une résistance du tampon de 1,6 kΩ, à part une pénalité d'échauffement simple au-delà de 10 V/cm.
Une largeur de bande due à la diffusion plus la largeur du puits ; la surcharge, le sel dans l'échantillon et les puits irréguliers, qui déforment les vraies bandes, sont laissés de côté.

Cas limites

Les fragments hors du marqueur reçoivent un point d'interrogation : la droite est prolongée au-delà de ses données et peut beaucoup se tromper.
Deux fragments de taille presque égale migrent en une seule bande, deux fois plus intense. Seule l'intensité les trahit ; une migration plus longue ou un gel plus dense peut les séparer.
Les très petits fragments (moins d'environ 100 pb dans un gel à 1 %) migrent avec le front du colorant et sont masqués par lui, et les bandes très pâles, sous environ 2 ng, n'apparaissent jamais.
Un fragment plus long que le plasmide est impossible dans une double digestion ; si la distance entre les coupures dépasse ce que permet le plasmide, la simulation la limite.
Dépasser le bout : peu après que le colorant a quitté le gel, la migration s'arrête, et les bandes sorties ne peuvent pas être mesurées.

Où le modèle cesse d'être juste

Au-delà d'environ 20 à 50 kb, l'ADN avance par reptation, en serpentant une extrémité en tête, et tous les longs fragments migrent ensemble. Les séparer demande l'électrophorèse en champ pulsé, que le modèle ne sait pas décrire.
Les gels de polyacrylamide séparent des fragments qui diffèrent d'une seule base, comme en séquençage ; l'agarose en est incapable, et la formule ne s'y applique pas.
Les protéines se séparent sur gel SDS-PAGE, selon un autre mécanisme (le SDS les recouvre d'une charge proportionnelle à leur longueur) ; pour elles, utilisez le Calcul de gel SDS-PAGE.
L'ADN simple brin et l'ARN se replient en formes qui changent leur vitesse ; ils demandent des gels dénaturants pour migrer selon leur taille.
Les vrais gels ne sont pas uniformes : un échauffement inégal, un gel incliné, du sel ou trop d'ADN dans une piste courbent et étalent les bandes d'une façon que l'on apprend à reconnaître et qu'un modèle ne montre pas.

Calculateurs

Coulez le gel avec le Calcul de gel d'agarose (et son guide, Faire un gel d'agarose), mesurez des bandes à partir de vos propres mesures avec Estimer la taille d'une bande sur gel et prévoyez les fragments d'une digestion avec la Carte de restriction.

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