Cómo funciona la electroforesis en gel y cómo leer un gel de ADN

Qué mueve el ADN

Cada nucleótido del ADN lleva una carga negativa en su fosfato, así que en un campo eléctrico el ADN se mueve hacia el electrodo positivo (el rojo; recuerda «corre hacia el rojo»). En solución libre la carga y la fricción crecen a la par con la longitud, de modo que un fragmento de 100 pb y otro de 10.000 pb irían igual de rápido. Lo que los separa es el gel: la agarosa forma una malla de poros, y las moléculas más largas se frenan más al abrirse paso por ella.

Qué decide dónde acaba una banda

• Longitud del fragmento. En el rango útil de un gel, la distancia recorrida cae más o menos en línea recta con el logaritmo de la longitud. Duplicar el tamaño hace retroceder una banda más o menos la misma distancia en cualquier punto de ese rango.
• Porcentaje de agarosa. Un gel más denso tiene poros más pequeños. A grandes rasgos: 0,7 % para 5 a 20 kb, 1 % para 0,5 a 10 kb, 1,5 % para 0,2 a 3 kb, 2 a 3 % para 50 pb a 1 kb.
• Intensidad del campo. La velocidad es proporcional a los voltios por centímetro entre los electrodos, no al voltaje en sí. Lo habitual son 5 a 8 V/cm; un minigel en una cubeta con los electrodos a 15 cm corre a unos 100 V.
• Forma. El plásmido superenrollado es compacto y corre por delante del ADN lineal de la misma longitud; el plásmido mellado (círculo abierto) se arrastra y queda detrás; el ARN y las hebras sencillas se pliegan y corren de forma imprevisible.
• Tampón y colorante. El TAE separa un poco mejor los fragmentos grandes y el TBE los pequeños. El bromuro de etidio frena algo el ADN, y los colorantes de carga corren con fragmentos de un tamaño que depende del gel: el azul de bromofenol con unos 300 a 500 pb en agarosa al 1 %, el xilencianol con unos 3 a 4 kb.

Medir una banda con el marcador

Un marcador es una mezcla de fragmentos de tamaño conocido que corre en su propio carril. Mide la distancia del pocillo a cada banda del marcador, representa log₁₀(tamaño) frente a la distancia y ajusta una recta: la curva estándar. Lee en la recta el tamaño de la banda desconocida.

Ejemplo: en un gel al 1 %, la banda de 3.000 pb del marcador recorrió 2,6 cm y la de 1.000 pb 4,0 cm. La recta que pasa por ambas tiene pendiente (log₁₀ 1.000 − log₁₀ 3.000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 por cm. Una banda desconocida a 3,3 cm está en log₁₀(tamaño) = log₁₀ 3.000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, así que su tamaño es 10^3,238 ≈ 1.730 pb. Usa las dos bandas del marcador que rodean a la desconocida, o una recta ajustada a varias, y no leas más allá de la última banda del marcador.

Cómo leer resultados habituales

• Plásmido sin cortar: dos o tres bandas, la superenrollada abajo, la mellada arriba y a veces la lineal entre ambas. Ninguna está en el tamaño real del plásmido según un marcador lineal.
• Plásmido linealizado (un corte): una banda en la longitud completa, buena prueba de que una sola enzima cortó.
• Doble digestión: fragmentos que deberían sumar el tamaño del plásmido. Si no suman, puede que un fragmento pequeño se haya salido del gel o sea demasiado tenue, o que dos fragmentos de tamaño parecido estén en una sola banda.
• Producto de PCR: una banda nítida en el tamaño esperado. Un barrido indica demasiado molde o demasiados ciclos; bandas de más, cebadores uniéndose donde no deben; una banda difusa abajo del todo, dímeros de cebadores.

Cómo usar la simulación

En el Simulador de electroforesis en gel, los carriles 1 a 6 llevan un marcador, un plásmido sin cortar, el plásmido cortado una y dos veces, un producto de PCR y los tamaños que escribas. La corrida empieza enseguida. Para cuando el frente del azul de bromofenol haya recorrido unas tres cuartas partes, y lee entonces los tamaños bajo la imagen, cada uno estimado con una recta ajustada a las bandas del marcador que siguen en el gel. Cosas que probar:

• Pon el carril 6 en 100, 150, 200 y corre un gel al 1 %: los tres corren juntos, justo por delante del frente del colorante. Repite al 2,5 % y se separan.
• Pon el carril 6 en 20000, 30000, 48000 en agarosa al 1 %: se amontonan en una banda, la movilidad límite.
• Sube el voltaje a 250 V: la corrida es rápida, pero las bandas se emborronan y los carriles centrales se adelantan a los de los bordes (la sonrisa) al calentarse el gel.
• Deja que la corrida siga: los fragmentos pequeños y el colorante se salen por el final y se pierden.

Qué supone el modelo

• Una fórmula empírica de movilidad, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) con L* = 2.000 pb × (1 % ÷ T)^1,4, elegida para dar posiciones realistas en agarosa del 0,5 al 3 % con TAE. Es un ajuste, no una teoría de cómo se mueve el ADN por los poros, y sus cifras son típicas, no exactas para ninguna marca de agarosa.
• Una movilidad límite para el ADN muy largo, por debajo de la cual ningún fragmento se frena más; en agarosa al 1 % se alcanza hacia los 20 kb.
• Factores de forma fijos para los plásmidos: el ADN superenrollado corre como un ADN lineal de 0,6 veces su longitud, el mellado como uno de 1,8 veces. En realidad los factores cambian con el porcentaje del gel, el voltaje, el grado de superenrollamiento y si hay bromuro de etidio en el gel.
• Cantidades iguales de cada fragmento en una digestión (equimolares), así que el brillo de una banda es proporcional a su longitud, y 300 ng de ADN por carril de muestra. Una banda necesita unos 2 ng para verse.
• Un campo y una temperatura uniformes en todo el gel, 15 cm entre electrodos y una resistencia del tampón de 1,6 kΩ, salvo una penalización simple por calentamiento por encima de 10 V/cm.
• Anchura de banda por difusión más la anchura del pocillo; la sobrecarga, la sal en la muestra y los pocillos irregulares, que deforman las bandas reales, quedan fuera.

Casos límite

• Los fragmentos fuera del marcador llevan un signo de interrogación: la recta se extrapola más allá de sus datos y puede equivocarse mucho.
• Dos fragmentos de casi el mismo tamaño corren como una sola banda, el doble de brillante. Solo el brillo lo delata; una corrida más larga o un gel más denso pueden separarlos.
• Los fragmentos muy pequeños (menos de unos 100 pb en agarosa al 1 %) corren con el frente del colorante y quedan tapados, y las bandas muy tenues, por debajo de unos 2 ng, nunca aparecen.
• Un fragmento más largo que el plásmido es imposible en una doble digestión; si la distancia entre cortes es mayor de lo que permite el plásmido, la simulación la limita.
• Pasarse del final: poco después de que el colorante sale del gel la corrida se detiene, y las bandas que se han salido no se pueden medir.

Dónde deja de valer el modelo

• Por encima de unos 20 a 50 kb el ADN se mueve por reptación, serpenteando con un extremo por delante, y todos los fragmentos largos corren juntos. Separarlos requiere electroforesis en campo pulsado, que el modelo no puede describir.
• Los geles de poliacrilamida separan fragmentos que difieren en una sola base, como en la secuenciación; la agarosa no puede, y la fórmula no vale para ellos.
• Las proteínas se separan en geles SDS-PAGE, por otro mecanismo (el SDS las recubre con una carga proporcional a su longitud); para ellas usa la Calculadora de geles SDS-PAGE.
• El ADN monocatenario y el ARN se pliegan en formas que cambian su velocidad; necesitan geles desnaturalizantes para correr por tamaño.
• Los geles reales no son uniformes: el calentamiento desigual, un gel inclinado, la sal o demasiado ADN en un carril doblan y emborronan las bandas de formas que quien lee geles aprende a reconocer y que un modelo no muestra.

Calculadoras

Prepara el gel con la Calculadora de gel de agarosa (y su guía, Cómo hacer un gel de agarosa), mide bandas con tus propias medidas en Estimar el tamaño de una banda en gel y predice los fragmentos de una digestión con el Mapa de restricción.