Como funciona a eletroforese em gel e como ler um gel de DNA

O que move o DNA

Cada nucleotídeo do DNA tem uma carga negativa no fosfato, então num campo elétrico o DNA se move para o eletrodo positivo (o vermelho; lembre-se: "corre para o vermelho"). Em solução livre a carga e o atrito crescem juntos com o comprimento, então um fragmento de 100 pb e um de 10.000 pb andariam na mesma velocidade. Quem os separa é o gel: a agarose forma uma malha de poros, e as moléculas mais longas são mais retidas ao passar por ela.

O que decide onde a banda para

• Comprimento do fragmento. Na faixa útil de um gel, a distância percorrida cai mais ou menos em linha reta com o logaritmo do comprimento. Dobrar o tamanho faz uma banda recuar mais ou menos a mesma distância em qualquer ponto dessa faixa.
• Porcentagem de agarose. Um gel mais denso tem poros menores. Em linhas gerais: 0,7 % para 5 a 20 kb, 1 % para 0,5 a 10 kb, 1,5 % para 0,2 a 3 kb, 2 a 3 % para 50 pb a 1 kb.
• Intensidade do campo. A velocidade é proporcional aos volts por centímetro entre os eletrodos, não à tensão em si. O usual é 5 a 8 V/cm; um minigel numa cuba com os eletrodos a 15 cm corre a cerca de 100 V.
• Forma. O plasmídeo superenovelado é compacto e corre à frente do DNA linear de mesmo comprimento; o plasmídeo cortado numa fita (círculo aberto) se arrasta e fica para trás; RNA e fitas simples se dobram e correm de forma imprevisível.
• Tampão e corante. O TAE separa um pouco melhor os fragmentos grandes, o TBE os pequenos. O brometo de etídio freia um pouco o DNA, e os corantes de carregamento correm junto com fragmentos de um tamanho que depende do gel: o azul de bromofenol com cerca de 300 a 500 pb em agarose a 1 %, o xileno cianol com cerca de 3 a 4 kb.

Medir uma banda com o marcador

Um marcador é uma mistura de fragmentos de tamanho conhecido que corre na própria canaleta. Meça a distância do poço até cada banda do marcador, faça o gráfico de log₁₀(tamanho) contra a distância e ajuste uma reta: a curva padrão. Leia na reta o tamanho da banda desconhecida.

Exemplo: num gel a 1 %, a banda de 3.000 pb do marcador andou 2,6 cm e a de 1.000 pb 4,0 cm. A reta pelas duas tem inclinação (log₁₀ 1.000 − log₁₀ 3.000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 por cm. Uma banda desconhecida a 3,3 cm fica em log₁₀(tamanho) = log₁₀ 3.000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, então seu tamanho é 10^3,238 ≈ 1.730 pb. Use as duas bandas do marcador em volta da desconhecida, ou uma reta ajustada a várias, e não leia além da última banda do marcador.

Lendo resultados comuns

• Plasmídeo não cortado: duas ou três bandas, a superenovelada embaixo, a cortada numa fita em cima e às vezes a linear entre elas. Nenhuma fica no tamanho real do plasmídeo num marcador linear.
• Plasmídeo linearizado (um corte): uma banda no comprimento total, uma boa prova de que uma única enzima cortou.
• Digestão dupla: fragmentos que deveriam somar o tamanho do plasmídeo. Se não somam, um fragmento pequeno pode ter saído do gel ou estar fraco demais, ou dois fragmentos de tamanho parecido podem estar numa só banda.
• Produto de PCR: uma banda nítida no tamanho esperado. Um rastro indica molde demais ou ciclos demais; bandas extras, primers se ligando em lugares errados; uma banda difusa bem embaixo, dímeros de primers.

Como usar a simulação

No Simulador de eletroforese em gel, as canaletas 1 a 6 têm um marcador, um plasmídeo não cortado, o plasmídeo cortado uma e duas vezes, um produto de PCR e os tamanhos que você digitar. A corrida começa na hora. Pare quando a frente do azul de bromofenol tiver percorrido cerca de três quartos do caminho e leia os tamanhos abaixo da imagem, cada um estimado por uma reta ajustada às bandas do marcador ainda no gel. O que testar:

• Ponha a canaleta 6 em 100, 150, 200 e rode um gel a 1 %: os três correm juntos, logo à frente do corante. Repita a 2,5 % e eles se separam.
• Ponha a canaleta 6 em 20000, 30000, 48000 em agarose a 1 %: eles se acumulam numa banda, a mobilidade limite.
• Aumente a tensão para 250 V: a corrida é rápida, mas as bandas borram e as canaletas do meio se adiantam às das bordas (o sorriso) quando o gel esquenta.
• Deixe a corrida continuar: os fragmentos pequenos e o corante saem pelo fim e se perdem.

O que o modelo supõe

• Uma fórmula empírica de mobilidade, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) com L* = 2.000 pb × (1 % ÷ T)^1,4, escolhida para dar posições realistas em agarose de 0,5 a 3 % com TAE. É um ajuste, não uma teoria de como o DNA atravessa os poros, e seus números são típicos, não exatos para alguma marca de agarose.
• Uma mobilidade limite para DNA muito longo, abaixo da qual nenhum fragmento fica mais lento; em agarose a 1 % ela é alcançada por volta de 20 kb.
• Fatores de forma fixos para plasmídeos: o DNA superenovelado corre como um DNA linear de 0,6 vez seu comprimento, o cortado numa fita como um de 1,8 vez. Na verdade os fatores mudam com a porcentagem do gel, a tensão, o grau de superenovelamento e a presença de brometo de etídio no gel.
• Quantidades iguais de cada fragmento numa digestão (equimolares), então o brilho de uma banda é proporcional ao comprimento, e 300 ng de DNA por canaleta de amostra. Uma banda precisa de cerca de 2 ng para aparecer.
• Campo e temperatura uniformes em todo o gel, 15 cm entre os eletrodos e uma resistência do tampão de 1,6 kΩ, exceto por uma penalidade simples de aquecimento acima de 10 V/cm.
• Largura de banda por difusão mais a largura do poço; excesso de amostra, sal na amostra e poços irregulares, que deformam bandas reais, ficam de fora.

Casos-limite

• Fragmentos fora do marcador recebem um ponto de interrogação: a reta é extrapolada além dos dados e pode errar muito.
• Dois fragmentos quase do mesmo tamanho correm como uma banda, com o dobro do brilho. Só o brilho denuncia; uma corrida mais longa ou um gel mais denso pode separá-los.
• Fragmentos muito pequenos (menos de cerca de 100 pb em agarose a 1 %) correm com a frente do corante e ficam escondidos por ela, e bandas muito fracas, abaixo de cerca de 2 ng, nunca aparecem.
• Um fragmento maior que o plasmídeo é impossível numa digestão dupla; se a distância entre os cortes for maior do que o plasmídeo permite, a simulação a limita.
• Passar do fim: pouco depois de o corante sair do gel a corrida para, e as bandas que saíram não podem ser medidas.

Onde o modelo deixa de valer

• Acima de cerca de 20 a 50 kb o DNA se move por reptação, serpenteando com uma ponta à frente, e todos os fragmentos longos correm juntos. Separá-los exige eletroforese em campo pulsado, que o modelo não descreve.
• Géis de poliacrilamida separam fragmentos que diferem em uma única base, como no sequenciamento; a agarose não consegue, e a fórmula não vale para eles.
• Proteínas são separadas em géis SDS-PAGE, por outro mecanismo (o SDS as cobre com uma carga proporcional ao comprimento); para elas use a Calculadora de géis SDS-PAGE.
• DNA de fita simples e RNA se dobram em formas que mudam sua velocidade; precisam de géis desnaturantes para correr por tamanho.
• Géis reais não são uniformes: aquecimento desigual, gel inclinado, sal ou DNA demais numa canaleta entortam e borram as bandas de maneiras que quem lê géis aprende a reconhecer e que um modelo não mostra.

Calculadoras

Prepare o gel com a Calculadora de gel de agarose (e o guia Como fazer um gel de agarose), meça bandas a partir das suas medidas em Estimar o tamanho de banda em gel e preveja os fragmentos de uma digestão com o Mapa de restrição.