Estimar o tamanho de banda em gel
Como estimar o tamanho de uma banda em gel
- Meça o quanto cada banda do marcador correu a partir do poço, em milímetros numa impressão ou em pixels numa foto, e escreva os tamanhos com as distâncias.
- Meça suas próprias bandas do mesmo jeito e escreva as distâncias.
- O tamanho de cada banda é lido na curva ajustada, com o R² do ajuste.
Perguntas frequentes
Como funciona o ajuste?
O DNA anda a uma velocidade que cai com o logaritmo do seu comprimento, então uma reta sobre log10(tamanho) contra a distância descreve bem quase todo o gel. O ajuste curvo acrescenta um termo quadrático, que acompanha as curvaturas do começo e do fim do gel.
De onde eu meço?
Do mesmo ponto em todas as bandas, em geral a borda da frente, medindo do fundo do poço. Misturar a borda de uma banda com o meio de outra é a maior fonte de erro.
Posso medir em pixels?
Sim. O ajuste só precisa que o marcador e suas bandas estejam na mesma unidade, então pixels de uma foto do gel servem tanto quanto milímetros de uma impressão. Garanta que a foto esteja de frente, não em ângulo.
Qual a precisão?
Dentro da faixa do marcador, normalmente de 5% a 10%. Fora dela o ajuste está extrapolando e pode errar muito, e é por isso que uma banda que correu além da menor banda do marcador é sinalizada.
Por que meu R² está baixo?
Ou uma distância foi digitada errada, ou o gel correu torto ou sorriu, ou os tamanhos do marcador não são os do marcador que você aplicou. Olhe primeiro os extremos; são eles que puxam mais o ajuste.
Quais tamanhos de marcador devo colocar?
Os que o tubo indicar. O padrão aqui é um marcador típico de 1 kb, mas marcadores variam entre fornecedores, então copie os tamanhos da sua própria ficha do produto.