DNA를 움직이는 힘
DNA의 뉴클레오타이드는 각각 인산에 음전하를 하나씩 띠므로 전기장에서 DNA는 양극(빨간 쪽)으로 움직입니다. "빨강으로 달린다"고 기억하면 편합니다. 자유 용액에서는 전하와 마찰이 함께 길이에 비례해 커지므로 100 bp 조각과 10,000 bp 조각이 같은 속력으로 움직입니다. 둘을 나누는 것은 겔입니다. 아가로스는 구멍이 있는 그물망을 만들고, 긴 분자일수록 그 사이를 빠져나갈 때 더 많이 붙잡힙니다.
밴드 위치를 정하는 것
- 조각 길이. 겔의 유효 범위에서 이동 거리는 길이의 로그에 따라 거의 직선으로 줄어듭니다. 크기가 두 배가 되면 그 범위 어디서나 밴드가 거의 같은 거리만큼 뒤처집니다.
- 아가로스 농도. 진한 겔일수록 구멍이 작습니다. 대략 5~20 kb는 0.7%, 0.5~10 kb는 1%, 0.2~3 kb는 1.5%, 50 bp~1 kb는 2~3%입니다.
- 전기장 세기. 속력은 전압 자체가 아니라 전극 사이 1 cm당 전압에 비례합니다. 보통 5~8 V/cm이며, 전극 간격이 15 cm인 탱크의 미니 겔은 약 100 V로 돌립니다.
- 모양. 초나선 플라스미드는 작고 단단해서 같은 길이의 선형 DNA보다 앞서가고, 닉이 있는 플라스미드(열린 고리)는 끌리듯 뒤처지며, RNA와 단일 가닥은 접혀서 예측하기 어렵게 움직입니다.
- 버퍼와 염료. TAE는 큰 조각을, TBE는 작은 조각을 조금 더 잘 나눕니다. 에티디움 브로마이드는 DNA를 약간 느리게 하고, 로딩 염료는 겔에 따라 정해지는 크기의 조각과 함께 움직입니다. 1% 아가로스에서 브로모페놀 블루는 약 300~500 bp, 자일렌 사이아놀은 약 3~4 kb와 같은 위치입니다.
래더로 밴드 크기 구하기
래더는 크기를 아는 조각들의 혼합물로, 자기 레인에서 함께 돌립니다. 웰에서 각 래더 밴드까지의 거리를 재고, log10(크기)를 거리에 대해 그린 뒤 직선을 맞춥니다. 이것이 표준 곡선입니다. 미지 밴드의 크기는 이 직선에서 읽습니다.
예시: 1% 겔에서 래더의 3,000 bp 밴드가 2.6 cm, 1,000 bp 밴드가 4.0 cm 이동했다고 합시다. 두 점을 지나는 직선의 기울기는 (log10 1,000 − log10 3,000) ÷ (4.0 − 2.6) = −0.477 ÷ 1.4 = −0.341 /cm입니다. 3.3 cm에 있는 미지 밴드는 log10(크기) = log10 3,000 − 0.341 × 0.7 = 3.477 − 0.239 = 3.238이므로 크기는 103.238 ≈ 1,730 bp입니다. 미지 밴드를 사이에 둔 래더 밴드 두 개나 여러 밴드에 맞춘 직선을 쓰고, 마지막 래더 밴드 바깥은 읽지 마세요.
흔한 결과 읽기
- 자르지 않은 플라스미드: 밴드 두세 개로, 초나선이 맨 아래, 닉이 있는 것이 맨 위, 때로 선형이 그 사이에 나옵니다. 선형 래더로 보면 어느 것도 플라스미드의 실제 크기 위치에 있지 않습니다.
- 선형화한 플라스미드(한 번 자름): 전체 길이 위치에 밴드 하나. 효소 하나가 잘랐다는 좋은 확인입니다.
- 이중 절단: 조각을 더하면 플라스미드 크기가 되어야 합니다. 그렇지 않다면 작은 조각이 겔 밖으로 빠졌거나 너무 희미하거나, 크기가 비슷한 두 조각이 한 밴드에 겹쳐 있을 수 있습니다.
- PCR 산물: 기대한 크기에 선명한 밴드 하나. 번짐은 주형이나 사이클이 너무 많다는 뜻이고, 여분의 밴드는 프라이머가 엉뚱한 곳에 붙었다는 뜻이며, 맨 아래의 흐린 밴드는 프라이머 다이머입니다.
시뮬레이션 사용법
겔 전기영동 시뮬레이터의 레인 1~6에는 래더, 자르지 않은 플라스미드, 한 번과 두 번 자른 플라스미드, PCR 산물, 입력한 크기가 들어 있습니다. 전기영동은 바로 시작됩니다. 브로모페놀 블루 선두가 약 4분의 3쯤 내려가면 멈추고 그림 아래에서 크기를 읽으세요. 각 크기는 아직 겔 위에 있는 래더 밴드에 맞춘 직선으로 추정합니다. 해 볼 만한 것:
- 레인 6을 100, 150, 200으로 하고 1% 겔을 돌리기: 세 밴드가 염료 선두 바로 앞에서 붙어 다닙니다. 2.5%로 다시 하면 나뉩니다.
- 1% 아가로스에서 레인 6을 20000, 30000, 48000으로 하기: 한 밴드로 겹칩니다. 한계 이동도입니다.
- 전압을 250 V로 올리기: 빨리 돌지만 겔이 뜨거워져 밴드가 번지고, 가운데 레인이 가장자리보다 앞서갑니다(웃는 모양).
- 계속 돌리기: 작은 조각과 염료가 끝으로 빠져나가 사라집니다.
모형의 가정
- 경험적 이동도 공식 μ = μ0 ÷ (1 + (L ÷ L*)0.9), L* = 2,000 bp × (1% ÷ T)1.4를 써서 TAE에서 0.5~3% 아가로스의 위치가 현실적으로 나오게 했습니다. 맞춤식일 뿐 DNA가 구멍을 지나는 이론이 아니며, 수치는 대표값이고 특정 아가로스 제품에 정확히 맞지는 않습니다.
- 아주 긴 DNA의 한계 이동도를 두어 그보다 느려지는 조각은 없다고 봅니다. 1% 아가로스에서는 약 20 kb에서 도달합니다.
- 플라스미드 모양 계수는 고정입니다. 초나선 DNA는 길이 0.6배인 선형 DNA처럼, 닉이 있는 DNA는 1.8배인 선형 DNA처럼 움직인다고 봅니다. 실제로는 겔 농도, 전압, 초나선 정도, 겔 속 에티디움 브로마이드 여부에 따라 계수가 달라집니다.
- 절단 조각은 같은 몰수로 보아 밴드 밝기가 길이에 비례하고, 시료 레인마다 DNA 300 ng을 넣었다고 봅니다. 밴드가 보이려면 약 2 ng이 필요합니다.
- 겔 전체에서 전기장과 온도가 균일하고, 전극 사이 15 cm, 버퍼 저항 1.6 kΩ이며, 10 V/cm를 넘을 때만 간단한 발열 벌점을 줍니다.
- 밴드 폭은 확산과 웰 폭으로 정해지며, 시료 과다, 시료 속 염, 고르지 않은 웰처럼 실제 밴드를 일그러뜨리는 요인은 넣지 않았습니다.
경계 사례
- 래더 범위 밖의 조각에는 물음표가 붙습니다. 직선을 데이터 밖까지 늘렸으므로 크게 틀릴 수 있습니다.
- 크기가 거의 같은 두 조각은 두 배 밝은 밴드 하나로 움직입니다. 밝기로만 알 수 있으며, 더 오래 돌리거나 진한 겔을 쓰면 나눌 수 있습니다.
- 아주 작은 조각(1% 아가로스에서 약 100 bp 미만)은 염료 선두와 함께 움직여 가려지고, 약 2 ng 미만인 아주 희미한 밴드는 나타나지 않습니다.
- 플라스미드보다 긴 조각은 이중 절단에서 불가능합니다. 절단 부위 간격을 플라스미드가 허용하는 것보다 크게 정하면 시뮬레이션이 제한합니다.
- 끝을 넘어 돌린 경우: 염료가 겔을 벗어나고 조금 뒤 전기영동이 멈추며, 빠져나간 밴드의 크기는 구할 수 없습니다.
모형이 맞지 않게 되는 경우
- 약 20~50 kb를 넘으면 DNA는 한쪽 끝을 앞세워 뱀처럼 나아가는 렙테이션으로 움직이고, 긴 조각은 모두 함께 움직입니다. 이를 나누려면 펄스장 겔 전기영동이 필요하며, 이 모형으로는 나타낼 수 없습니다.
- 폴리아크릴아마이드 겔은 염기서열 분석처럼 염기 하나 차이 나는 조각도 나눕니다. 아가로스로는 불가능하고, 이 공식은 맞지 않습니다.
- 단백질은 SDS-PAGE 겔에서 다른 원리(SDS가 길이에 비례하는 전하를 입힘)로 나눕니다. 이때는 SDS-PAGE 겔 계산기를 쓰세요.
- 단일 가닥 DNA와 RNA는 접혀서 속력이 달라지므로, 크기대로 움직이게 하려면 변성 겔이 필요합니다.
- 실제 겔은 균일하지 않습니다: 고르지 않은 발열, 기울어진 겔, 염, 한 레인에 너무 많은 DNA는 밴드를 휘거나 번지게 하며, 겔을 읽는 사람은 이를 알아보게 되지만 모형에는 나타나지 않습니다.
계산기
겔은 아가로스 겔 계산기(와 가이드 아가로스 겔 만드는 방법)로 만들고, 직접 잰 값으로 밴드 크기를 구할 때는 젤 띠 크기 추정을, 절단으로 생길 조각을 예측할 때는 제한효소 지도를 쓰세요.