DNA’yı ne sürükler
DNA’daki her nükleotit fosfatında bir negatif yük taşır; yani bir elektrik alanında DNA pozitif elektroda (kırmızı olana) doğru hareket eder. Serbest çözeltide hem yük hem sürtünme uzunlukla birlikte arttığı için 100 bp’lik bir parça ile 10.000 bp’lik bir parça aynı hızla hareket ederdi. Onları ayıran şey jeldir: agaroz, gözeneklerden oluşan bir ağ halinde donar ve uzun moleküller onun içinde kıvrılırken daha fazla engellenir.
Bir bandın nerede duracağına ne karar verir
- Parça uzunluğu. Bir jelin kullanışlı aralığında alınan yol, uzunluğun logaritmasıyla kabaca doğrusal olarak azalır. Boyutu iki katına çıkarmak, o aralığın herhangi bir yerinde bir bandı aşağı yukarı aynı mesafe kadar geri alır.
- Agaroz yüzdesi. Daha yoğun bir jelin gözenekleri daha küçüktür. Kabaca: 5 ila 20 kb için %0,7; 0,5 ila 10 kb için %1; 0,2 ila 3 kb için %1,5; 50 bp ila 1 kb için %2 ila 3.
- Alan şiddeti. Hız, gerilimin kendisiyle değil, elektrotlar arasındaki santimetre başına gerilimle doğru orantılıdır. 5 ila 8 V/cm olağandır; elektrotları 15 cm aralıklı bir tankta mini jel yaklaşık 100 V’ta yürür.
- Biçim. Süpersarmal plazmit kompakttır ve aynı uzunluktaki doğrusal DNA’nın önünde yürür; çentikli (açık halka) plazmit sürüklenir ve geride kalır; RNA ve tek iplikler katlanır ve öngörülemez biçimde yürür.
- Tampon ve boya. TAE büyük parçaları biraz daha iyi, TBE küçükleri daha iyi ayırır. Etidyum bromür DNA’yı hafifçe yavaşlatır ve yükleme boyaları jele bağlı bir boyuttaki parçalarla birlikte yürür: %1 agarozda bromofenol mavisi yaklaşık 300 ila 500 bp ile, ksilen siyanol yaklaşık 3 ila 4 kb ile.
Bir bandı merdivenden boyutlandırmak
Merdiven, kendi kuyusunda yürütülen, boyutları bilinen parçaların karışımıdır. Kuyucuktan her merdiven bandına olan mesafeyi ölç, log10(boyut)’u mesafeye karşı çiz ve bir doğru uydur: standart eğri. Bilinmeyen bir bandın boyutunu bu doğrudan oku.
Çözümlü örnek: %1’lik bir jelde 3.000 bp’lik merdiven bandı 2,6 cm, 1.000 bp’lik bant 4,0 cm yürüdü. Onlardan geçen doğrunun eğimi (log10 1.000 − log10 3.000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = cm başına −0,341’dir. 3,3 cm’deki bilinmeyen bir bant için log10(boyut) = log10 3.000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238; yani boyutu 103,238 ≈ 1.730 bp’dir. Bilinmeyenin iki yanındaki merdiven bantlarını ya da birkaçından geçirilen bir doğruyu kullan ve son merdiven bandının ötesine okuma yapma.
Yaygın sonuçları okumak
- Kesilmemiş plazmit: iki ya da üç bant; en altta süpersarmal, en üstte çentikli, arada bazen doğrusal. Hiçbiri doğrusal bir merdivende plazmitin gerçek boyutunda durmaz.
- Doğrusallaştırılmış plazmit (tek kesim): tam uzunlukta tek bir bant; tek bir enzimin kestiğinin iyi bir kanıtı.
- Çift kesim: toplamları plazmitin boyutunu vermesi gereken parçalar. Vermiyorsa küçük bir parça jelden akıp gitmiş ya da görülemeyecek kadar soluk olabilir veya benzer boyutta iki parça tek bir bantta oturuyor olabilir.
- PCR ürünü: beklenen boyutta tek bir keskin bant. Bulaşma çok fazla kalıp ya da çok fazla döngü demektir; fazladan bantlar primerlerin yanlış yerlere bağlandığını; dipteki bulanık bant da primer dimerlerini gösterir.
Simülasyonu kullanmak
Jel elektroforezi simülatöründe 1’den 6’ya kadar kuyucuklarda bir merdiven, kesilmemiş bir plazmit, bir ve iki kez kesilmiş plazmit, bir PCR ürünü ve yazdığın boyutlar bulunur. Yürütme hemen başlar. Bromofenol mavisi cephesi yolun yaklaşık dörtte üçüne geldiğinde durdur, sonra resmin altındaki boyutları oku; her biri jelde kalan merdiven bantlarına uydurulan bir doğrudan tahmin edilir. Denenecek şeyler:
- 6. kuyucuğu 100, 150, 200 yap ve %1’lik bir jel yürüt: üçü boya cephesinin hemen önünde birbirine yakın yürür. %2,5’te yeniden yürüt ve ayrıldıklarını gör.
- 6. kuyucuğu %1 agarozda 20000, 30000, 48000 yap: sınır hareketliliği olan tek bir bantta yığılırlar.
- Gerilimi 250 V’a çıkar: yürütme hızlıdır, ama jel ısındıkça bantlar bulanır ve orta kuyucuklar kenarların önüne geçer (gülme).
- Yürütmenin devam etmesine izin ver: küçük parçalar ve boya uçtan akıp gider ve kaybolur.
Modelin varsayımları
- Deneysel bir hareketlilik formülü: μ = μ0 ÷ (1 + (L ÷ L*)0,9), L* = 2.000 bp × (%1 ÷ T)1,4; TAE içinde %0,5 ila 3 agaroz için gerçekçi konumlar verecek şekilde seçilmiştir. Bu bir uydurmadır, DNA’nın gözeneklerden nasıl geçtiğinin bir teorisi değildir ve sayıları herhangi bir agaroz markası için kesin değil, tipiktir.
- Çok uzun DNA için, altında hiçbir parçanın yavaşlamadığı bir sınır hareketliliği; %1 agarozda bu yaklaşık 20 kb’de ulaşılır.
- Plazmitler için sabit biçim katsayıları: süpersarmal DNA, uzunluğunun 0,6 katı doğrusal DNA gibi; çentikli olan 1,8 katı gibi yürür. Gerçekte bu katsayılar jel yüzdesiyle, gerilimle, süpersarmallık miktarıyla ve jelde etidyum bromür olup olmamasıyla değişir.
- Bir kesimde her parçadan eşit miktar (eş molar); yani bant parlaklığı uzunlukla orantılıdır ve örnek kuyucuğu başına 300 ng DNA vardır. Bir bandın görünmesi için yaklaşık 2 ng gerekir.
- 10 V/cm’nin üstündeki basit bir ısınma cezası dışında jel boyunca düzgün bir alan ve sıcaklık, elektrotlar arasında 15 cm ve 1,6 kΩ tampon direnci.
- Yayınımdan gelen bant genişliği artı kuyucuğun genişliği; gerçek bantları bozan aşırı yükleme, örnekteki tuz ve düzgün olmayan kuyucuklar dışarıda bırakılmıştır.
Sınır durumları
- Merdivenin dışındaki parçalar soru işareti alır: doğru verisinin ötesine uzatılır ve fena halde yanlış olabilir.
- Neredeyse aynı boyutta iki parça iki kat parlak tek bir bant olarak yürür. Bunu yalnızca parlaklık belli eder; daha uzun bir yürütme ya da daha yoğun bir jel onları ayırabilir.
- Çok küçük parçalar (%1 agarozda yaklaşık 100 bp’nin altı) boya cephesiyle birlikte yürür ve onun altında gizlenir; yaklaşık 2 ng’ın altındaki çok soluk bantlar da hiç görünmez.
- Çift kesimde plazmitten uzun bir parça olanaksızdır; kesim mesafesi plazmitin izin verdiğinden büyük ayarlanırsa simülasyon onu sınırlar.
- Uçtan taşmak: boya jelden çıktıktan kısa süre sonra yürütme durur ve çıkmış bantlar boyutlandırılamaz.
Modelin doğru olmaktan çıktığı yerler
- Yaklaşık 20 ila 50 kb’nin üstünde DNA, ucu önde kıvrılarak (reptasyon) hareket eder ve bütün uzun parçalar birlikte yürür. Onları ayırmak için modelin tanımlayamadığı darbeli alan jel elektroforezi gerekir.
- Poliakrilamid jeller, dizilemede olduğu gibi tek bir bazla farklı parçaları ayırır; agaroz bunu yapamaz ve formül onlara uygulanmaz.
- Proteinler SDS-PAGE jellerinde farklı bir mekanizmayla ayrılır (SDS onları uzunlukla orantılı bir yükle kaplar); onlar için SDS-PAGE jel hesaplayıcıyı kullan.
- Tek iplikli DNA ve RNA hızlarını değiştiren biçimlere katlanır; boyutlarına göre yürümeleri için denatüre edici jeller gerekir.
- Gerçek jeller düzgün değildir: düzensiz ısınma, eğimli bir jel, bir kuyucuktaki tuz ya da çok fazla DNA, bantları bir okurun fark etmeyi öğrendiği ama bir modelin göstermediği biçimlerde büker ve bulaştırır.
Hesaplayıcılar
Jeli Agaroz jel hesaplayıcı (ve kılavuzu, Agaroz jel nasıl hazırlanır) ile dök, bantları kendi ölçümlerinden Jel bant boyutu tahmincisi ile boyutlandır ve bir kesimin parçalarını Kesim haritası ile öngör.