Как работает гель-электрофорез и как читать гель с ДНК

Что движет ДНК

Каждый нуклеотид ДНК несёт один отрицательный заряд на фосфате, поэтому в электрическом поле ДНК движется к положительному электроду (красному). В свободном растворе и заряд, и трение растут пропорционально длине, так что фрагменты в 100 и 10 000 п. н. двигались бы с одной скоростью. Разделяет их гель: агароза застывает в сетку пор, и более длинные молекулы сильнее задерживаются, пробираясь сквозь неё.

Что определяет положение полосы

• Длина фрагмента. В рабочем диапазоне геля пройденное расстояние убывает примерно линейно с логарифмом длины. Удвоение размера отодвигает полосу назад примерно на одно и то же расстояние в любом месте этого диапазона.
• Процент агарозы. У более плотного геля поры меньше. Примерно: 0,7% для 5–20 т. п. н., 1% для 0,5–10 т. п. н., 1,5% для 0,2–3 т. п. н., 2–3% для 50 п. н. – 1 т. п. н.
• Напряжённость поля. Скорость пропорциональна напряжению на сантиметр между электродами, а не самому напряжению. Обычно 5–8 В/см; мини-гель в камере с электродами на расстоянии 15 см идёт при 100 В.
• Форма. Суперскрученная плазмида компактна и идёт впереди линейной ДНК той же длины; плазмида с одноцепочечным разрывом (открытое кольцо) тормозит и идёт позади; РНК и одноцепочечные молекулы сворачиваются и идут непредсказуемо.
• Буфер и краситель. TAE чуть лучше разделяет большие фрагменты, TBE — маленькие. Бромистый этидий слегка замедляет ДНК, а красители для нанесения идут вместе с фрагментами размера, зависящего от геля: бромфеноловый синий — с фрагментами около 300–500 п. н. в 1% агарозе, ксиленцианол — около 3–4 т. п. н.

Размер полосы по маркеру

Маркер — смесь фрагментов известного размера в отдельной дорожке. Измерьте расстояние от лунки до каждой полосы маркера, постройте log₁₀(размер) против расстояния и проведите прямую: это стандартная кривая. Размер неизвестной полосы считывается с прямой.

Разобранный пример: в 1% геле полоса маркера 3000 п. н. прошла 2,6 см, а полоса 1000 п. н. — 4,0 см. Наклон прямой через них (log₁₀ 1000 − log₁₀ 3000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 на см. Неизвестная полоса на 3,3 см имеет log₁₀(размер) = log₁₀ 3000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, значит, её размер 10^3,238 ≈ 1730 п. н. Используйте две полосы маркера по обе стороны от неизвестной или прямую, проведённую через несколько, и не считывайте за пределами последней полосы маркера.

Чтение типичных результатов

• Неразрезанная плазмида: две-три полосы, суперскрученная ниже всех, открытое кольцо выше всех, иногда между ними линейная. Ни одна не стоит на истинном размере плазмиды по линейному маркеру.
• Линеаризованная плазмида (один разрез): одна полоса на полной длине — хорошая проверка, что фермент резал один раз.
• Двойной гидролиз: фрагменты, которые в сумме должны давать размер плазмиды. Если не дают, маленький фрагмент мог уйти с геля или быть слишком бледным, или два фрагмента похожего размера сидят в одной полосе.
• Продукт ПЦР: одна чёткая полоса ожидаемого размера. Шмер — слишком много матрицы или циклов; лишние полосы — праймеры связываются не там; размытая полоса внизу — праймер-димеры.

Как пользоваться симуляцией

В Симулятор гель-электрофореза в дорожках 1–6 — маркер, неразрезанная плазмида, плазмида, разрезанная один и два раза, продукт ПЦР и размеры, которые вы вводите. Электрофорез начинается сразу. Остановите его, когда фронт бромфенолового синего пройдёт примерно три четверти геля, затем прочитайте размеры под картинкой, каждый оценён по прямой через полосы маркера, оставшиеся на геле. Попробуйте:

• Задайте в дорожке 6 значения 100, 150, 200 и запустите 1% гель: три фрагмента идут рядом, чуть впереди фронта красителя. Повторите при 2,5%, и они разделятся.
• Задайте в дорожке 6 значения 20000, 30000, 48000 в 1% агарозе: они сливаются в одну полосу — предельная подвижность.
• Поднимите напряжение до 250 В: электрофорез идёт быстро, но полосы размываются, а средние дорожки обгоняют края («улыбка»), потому что гель нагревается.
• Дайте электрофорезу идти дальше: маленькие фрагменты и краситель уходят с конца геля и теряются.

Что предполагает модель

• Эмпирическая формула подвижности, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) с L* = 2000 п. н. × (1% ÷ T)^1,4, подобранная так, чтобы давать реалистичные положения для 0,5–3% агарозы в TAE. Это подгонка, а не теория движения ДНК через поры, и её числа типичны, а не точны для какой-либо марки агарозы.
• Предельная подвижность для очень длинной ДНК, ниже которой ни один фрагмент не замедляется; в 1% агарозе она достигается около 20 т. п. н.
• Фиксированные коэффициенты формы для плазмид: суперскрученная ДНК идёт как линейная длиной 0,6 от своей, открытое кольцо — как 1,8. В реальности коэффициенты зависят от процента геля, напряжения, степени суперскрученности и наличия бромистого этидия в геле.
• Равные количества каждого фрагмента в гидролизате (эквимолярные), так что яркость полосы пропорциональна длине, и 300 нг ДНК на дорожку с образцом. Чтобы полоса была видна, нужно около 2 нг.
• Однородное поле и температура по всему гелю, 15 см между электродами и сопротивление буфера 1,6 кОм, не считая простого штрафа за нагрев выше 10 В/см.
• Ширина полосы от диффузии плюс ширина лунки; перегрузка, соль в образце и неровные лунки, которые искажают настоящие полосы, не учитываются.

Крайние случаи

• Фрагменты вне маркера получают вопросительный знак: прямая экстраполируется за пределы данных и может сильно ошибаться.
• Два фрагмента почти одного размера идут одной полосой вдвое ярче. Выдаёт их только яркость; более долгий электрофорез или более плотный гель может их разделить.
• Очень маленькие фрагменты (меньше примерно 100 п. н. в 1% агарозе) идут с фронтом красителя и скрыты им, а очень бледные полосы меньше примерно 2 нг не видны вовсе.
• Фрагмент длиннее плазмиды в двойном гидролизе невозможен; если расстояние между разрезами задано больше, чем позволяет плазмида, симуляция его ограничивает.
• Выход за конец геля: вскоре после того, как краситель покидает гель, электрофорез останавливается, и размер ушедших полос определить нельзя.

Где модель перестаёт быть верной

• Выше примерно 20–50 т. п. н. ДНК движется рептацией, проползая концом вперёд, и все длинные фрагменты идут вместе. Для их разделения нужен пульс-электрофорез, который модель описать не может.
• Полиакриламидные гели разделяют фрагменты, различающиеся на одно основание, как при секвенировании; агароза так не может, и формула к ним не применима.
• Белки разделяют в гелях SDS-ПААГ по другому механизму (SDS покрывает их зарядом, пропорциональным длине); для них используйте Калькулятор геля для SDS-ПААГ.
• Одноцепочечная ДНК и РНК сворачиваются в структуры, меняющие их скорость; чтобы они шли по размеру, нужны денатурирующие гели.
• Настоящие гели неоднородны: неравномерный нагрев, наклонный гель, соль или избыток ДНК в дорожке изгибают и размывают полосы так, что опытный глаз это замечает, а модель не показывает.

Калькуляторы

Залейте гель с помощью Калькулятор агарозного геля (и его руководства Как приготовить агарозный гель), определяйте размер полос по своим измерениям в Оценка размера полос в геле и предсказывайте фрагменты гидролиза в Рестрикционная карта.