Как работает хроматография: Rf, колонки и разрешение

Две фазы

В любом виде хроматографии есть неподвижная фаза, которая остаётся на месте (целлюлоза бумаги, силикагель пластинки ТСХ, наполнитель колонки), и подвижная фаза, которая течёт мимо неё (растворитель или газ в газовой хроматографии). Каждое вещество смеси постоянно переходит между ними: растворённое в подвижной фазе, оно движется, прилипшее к неподвижной — ждёт. Вещество, которое дольше остаётся прилипшим, движется медленнее, поэтому вещества, различающиеся силой удерживания, расходятся.

Отношение времени в прилипшем состоянии ко времени движения — это коэффициент удерживания k. Вещество с k = 1 движется половину времени и перемещается вдвое медленнее растворителя.

Полярность

Силикагель и целлюлоза полярны, покрыты группами OH, образующими водородные связи. Полярные вещества (сахара, аминокислоты, хлорофилл b) к ним липнут; неполярные (каротин, жиры) — почти нет. Растворитель конкурирует за те же места: более полярный растворитель вытесняет полярные вещества и уносит их дальше. Поэтому на пластинке с силикагелем гексан двигает только неполярные вещества, этилацетат — умеренно полярные, а этанол или вода — почти всё, что растворяется. Обращённо-фазовые колонки, покрытые длинными углеводородными цепями, переворачивают это: там липнут неполярные вещества.

Значения Rf

На бумаге или пластинке ТСХ растворитель ползёт вверх снизу, и хроматографию останавливают, прежде чем он дойдёт до верха. Каждое пятно проходит постоянную долю пути растворителя:

R_f = путь пятна ÷ путь фронта растворителя = 1 ÷ (1 + k)

Оба расстояния отсчитываются от линии старта, где нанесён образец. R_f лежит между 0 и 1, и для данной пластинки, растворителя и температуры каждое вещество каждый раз имеет примерно тот же R_f, поэтому неизвестное пятно можно сопоставить со стандартом, нанесённым рядом.

Разобранный пример

Экстракт шпината разделяют на пластинке с силикагелем в смеси гексана и ацетона 9:1. Фронт останавливается на 6,0 см выше линии старта.

1. Оранжевое пятно на 5,7 см: R_f = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, β-каротин, наименее полярный пигмент.
2. Сине-зелёное пятно на 2,7 см: R_f = 0,45, хлорофилл a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
3. Жёлто-зелёное пятно на 2,1 см: R_f = 0,35, хлорофилл b, у которого лишняя группа C=O, и он полярнее.
4. Жёлтое пятно на 1,5 см: R_f = 0,25, ксантофиллы с группами OH, которые цепляются за силикагель.

Порядок следует полярности, наименее полярные — вверху. Опубликованные значения для этих пигментов различаются от лаборатории к лаборатории в зависимости от пластинки, смеси растворителей и сухости пластинки, поэтому рядом наносят стандарты.

Колонки и хроматограммы

В колоночной хроматографии (а также ВЭЖХ и газовой хроматографии) подвижная фаза течёт через заполненную трубку, и вещества выходят из конца одно за другим в детектор, который рисует пик для каждого. Сам растворитель проходит за мёртвое время t₀; вещество с коэффициентом удерживания k выходит за

t_R = t₀ (1 + k)

Пики расширяются по пути, потому что молекулы идут через наполнитель разными путями и диффундируют. Эффективность колонки — её число теоретических тарелок N: ширина пика (стандартное отклонение) σ = t_R ÷ √N. У хорошей колонки ВЭЖХ 10 000 тарелок и больше; у колонки, набитой вручную для гравитационной хроматографии, — может быть, несколько сотен.

Продолжим пример на колонке с t₀ = 2,7 мин и N = 2000: хлорофилл a (k = 1,22) выходит на 2,7 × 2,22 = 6,0 мин с σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 мин; хлорофилл b (k = 1,86) — на 7,7 мин с σ = 0,17 мин.

Разрешение

Разделены ли два соседа, зависит и от промежутка между ними, и от их ширины:

R_s = 2 (t_R2 − t_R1) ÷ (w₁ + w₂), где ширина у основания w = 4σ

Для двух хлорофиллов R_s = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: чисто разделены. R_s = 1,5 даёт разделение до базовой линии; при 1 пики перекрываются примерно на 2%; ниже — сливаются. Уравнение Пурнелла показывает три способа его улучшить:

R_s = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))

где α = k₂ ÷ k₁. Лучшая колонка (больше N) помогает лишь как квадратный корень; смена растворителя, меняющая α — насколько по-разному удерживаются два вещества, — обычно помогает гораздо сильнее.

Как пользоваться симуляцией

В Симулятор хроматографии попробуйте:

• Пигменты листа в гексане с ацетоном, затем в чистом гексане: в гексане движется только каротин; хлорофиллы остаются у линии старта.
• Чёрные чернила в воде: красители разделяются; в гексане они вообще не движутся, потому что не растворяются.
• Аминокислоты в бутаноле, уксусной кислоте и воде: ничего не видно, пока не отметите «Проявить нингидрином (аминокислоты)», и тогда лейцин и фенилаланин почти перекрываются.
• Сделайте пятно шириной 6 мм: все пятна растут, и соседи сливаются.
• На колонке уменьшите N с 2000 до 200 и смотрите, как пики расширяются, а разрешение падает.

Что предполагает модель

• Единая шкала полярности. У каждого вещества одно число полярности, подобранное так, чтобы его R_f совпадал с опубликованным значением в одном эталонном растворителе, а у каждого растворителя — одно по шкале от 0 до 1; k = e^{8(p − s)}. Реальное удерживание зависит от водородных связей, кислотности, размера и формы, а не от одного числа.
• Растворимость как переключатель. Красители чернил растворяются только в полярных растворителях, пигменты листа — в чём угодно, кроме воды, аминокислоты — только в достаточно полярных; иначе R_f = 0.
• Одна и та же неподвижная фаза для бумаги, ТСХ и колонки.
• Фронт поднимается как квадратный корень из времени (закон Лукаса — Уошберна), со скоростью, зависящей от растворителя.
• Пятна и пики гауссовы, расширяются с расстоянием за счёт диффузии; количества малы, поэтому перегрузки нет.
• Колонка 25 см, диаметром 4,6 мм, 65% свободного объёма, так что t₀ = 2,7 мл ÷ скорость потока.

Крайние случаи

• R_f около 0 или 1: вещества скапливаются у линии старта или у фронта, и их не различить. Подбирайте растворитель так, чтобы R_f были примерно от 0,2 до 0,8.
• Растворитель выше линии старта: пятна смываются в растворитель внизу, а не поднимаются.
• Бесцветные вещества требуют проявления (нингидрин для аминокислот, пары йода, УФ-свет на флуоресцентной пластинке), чтобы их вообще увидеть.
• Одинаковый R_f не доказывает, что вещества одинаковы; разделите их во втором растворителе или нанесите рядом и вместе (совместное нанесение).

Где модель перестаёт быть верной

• Хвосты и перегрузка. Слишком много образца или кислые и основные вещества на силикагеле дают полосы и пятна в форме комет вместо аккуратных кружков.
• Смешанные растворители сами разделяются. Более полярная часть смеси задерживается пластинкой, поэтому состав растворителя меняется вверх по пластинке, а в сухой ненасыщенной камере растворитель испаряется с пластинки по мере подъёма; и то и другое сдвигает R_f.
• Температура и влажность меняют R_f, а силикагель, набравший воды из воздуха, становится менее активным.
• Градиентное элюирование, когда растворитель постепенно делают сильнее в ходе разделения на колонке, — так проводится большая часть ВЭЖХ; эта модель держит растворитель постоянным.
• Другие механизмы. Ионообменная, эксклюзионная и аффинная хроматография разделяют по заряду, размеру и специфическому связыванию, а не по полярности.

Связанные инструменты

Симулятор гель-электрофореза разделяет ДНК по размеру — другой способ разобрать смесь; Симулятор спектрофотометра и закона Бугера — Ламберта — Бера показывает, как детектор измеряет количество выходящего вещества; а 3D-просмотр молекул показывает полярные группы, из-за которых молекулы липнут.