Deux phases
Toute chromatographie a une phase stationnaire qui reste en place (la cellulose du papier, le gel de silice d'une plaque de chromatographie sur couche mince, le remplissage d'une colonne) et une phase mobile qui passe dessus (un solvant, ou un gaz en chromatographie en phase gazeuse). Chaque composé du mélange va et vient sans cesse entre les deux : dissous dans la phase mobile, il avance ; fixé sur la phase stationnaire, il attend. Un composé qui passe plus de temps fixé avance plus lentement, donc des composés qui s'accrochent plus ou moins fort se séparent.
Le rapport entre le temps passé fixé et le temps passé en mouvement est le facteur de rétention k. Un composé avec k = 1 passe la moitié de son temps à bouger et avance à la moitié de la vitesse du solvant.
La polarité
La silice et la cellulose sont polaires, couvertes de groupes OH qui forment des liaisons hydrogène. Les composés polaires (sucres, acides aminés, chlorophylle b) s'y accrochent ; les apolaires (carotène, graisses) à peine. Le solvant se dispute les mêmes sites : un solvant plus polaire déloge les composés polaires et les emmène plus loin. Sur une plaque de silice, l'hexane ne déplace donc que les composés apolaires, l'acétate d'éthyle les composés moyennement polaires, et l'éthanol ou l'eau presque tout ce qui se dissout. Les colonnes en phase inverse, recouvertes de longues chaînes hydrocarbonées, renversent la situation : ce sont alors les composés apolaires qui s'accrochent.
Les valeurs Rf
Sur du papier ou une plaque, le solvant monte depuis le bas et on arrête l'élution avant qu'il atteigne le haut. Chaque tache a parcouru une fraction fixe de la distance du solvant :
Rf = distance parcourue par la tache ÷ distance parcourue par le front du solvant = 1 ÷ (1 + k)
Les deux distances se mesurent depuis la ligne de dépôt où l'échantillon a été posé. Rf est compris entre 0 et 1, et pour une plaque, un solvant et une température donnés, chaque composé a à peu près le même Rf à chaque fois, si bien qu'on peut comparer une tache inconnue à un témoin déposé à côté.
Un exemple chiffré
Un extrait d'épinard est élué sur une plaque de silice avec de l'hexane et de l'acétone, 9 pour 1. Le front s'arrête à 6,0 cm au-dessus de la ligne de dépôt.
- Une tache orange à 5,7 cm : Rf = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, le β-carotène, le pigment le moins polaire.
- Une tache bleu-vert à 2,7 cm : Rf = 0,45, la chlorophylle a ; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
- Une tache vert-jaune à 2,1 cm : Rf = 0,35, la chlorophylle b, qui a un groupe C=O de plus et est plus polaire.
- Une tache jaune à 1,5 cm : Rf = 0,25, les xanthophylles, dont les groupes OH s'agrippent à la silice.
L'ordre suit la polarité, le moins polaire en haut. Les valeurs publiées pour ces pigments varient d'un laboratoire à l'autre selon la plaque, le mélange de solvants et la sécheresse de la plaque, c'est pourquoi on dépose des témoins à côté.
Colonnes et chromatogrammes
En chromatographie sur colonne (comme en CLHP et en chromatographie en phase gazeuse), la phase mobile s'écoule dans un tube rempli et les composés sortent à l'autre bout l'un après l'autre, vers un détecteur qui trace un pic pour chacun. Le solvant lui-même met le temps mort t₀ à traverser ; un composé de facteur de rétention k met
tR = t₀ (1 + k)
Les pics s'élargissent en chemin, parce que les molécules prennent des chemins différents dans le remplissage et diffusent. L'efficacité d'une colonne est son nombre de plateaux théoriques N : la largeur du pic (écart type) vaut σ = tR ÷ √N. Une bonne colonne de CLHP a 10 000 plateaux ou plus ; une colonne par gravité remplie à la main, peut-être quelques centaines.
Pour poursuivre l'exemple sur une colonne avec t₀ = 2,7 min et N = 2 000 : la chlorophylle a (k = 1,22) sort à 2,7 × 2,22 = 6,0 min avec σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 min ; la chlorophylle b (k = 1,86) à 7,7 min avec σ = 0,17 min.
La résolution
Que deux voisins soient séparés dépend à la fois de l'écart entre eux et de leur largeur :
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), avec la largeur à la base w = 4σ
Pour les deux chlorophylles, Rs = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8 : bien séparées. Rs = 1,5 donne une séparation jusqu'à la ligne de base ; à 1, les pics se chevauchent d'environ 2 % ; en dessous, ils se confondent. L'équation de Purnell montre les trois façons de l'améliorer :
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
avec α = k₂ ÷ k₁. Une meilleure colonne (N plus grand) n'aide qu'en racine carrée ; changer de solvant pour changer α, c'est-à-dire la différence d'accroche entre les deux composés, aide en général bien davantage.
Utiliser la simulation
Dans le Simulateur de chromatographie, à essayer :
- Les pigments de feuille dans l'hexane et l'acétone, puis dans l'hexane pur : dans l'hexane seul le carotène bouge ; les chlorophylles restent près de la ligne de dépôt.
- L'encre noire dans l'eau : les colorants se séparent ; dans l'hexane ils ne bougent pas du tout, car ils ne s'y dissolvent pas.
- Les acides aminés dans le butanol, l'acide acétique et l'eau : rien n'apparaît tant que vous ne cochez pas Révéler à la ninhydrine, puis la leucine et la phénylalanine se chevauchent presque.
- Faites une tache de 6 mm : toutes les taches grossissent et les voisines se confondent.
- Sur la colonne, faites passer N de 2 000 à 200 et regardez les pics s'élargir et la résolution chuter.
Ce que le modèle suppose
- Une seule échelle de polarité. Chaque composé a un nombre de polarité, choisi pour que son Rf corresponde à une valeur publiée dans un solvant de référence, et chaque solvant en a un sur une échelle de 0 à 1 ; k = e8(p − s). La rétention réelle dépend des liaisons hydrogène, de l'acidité, de la taille et de la forme, pas d'un seul nombre.
- La solubilité comme interrupteur. Les colorants d'encre ne se dissolvent que dans les solvants polaires, les pigments de feuille dans tout sauf l'eau, les acides aminés seulement dans les solvants assez polaires ; sinon Rf = 0.
- La même phase stationnaire pour le papier, la couche mince et la colonne.
- Un front qui monte comme la racine carrée du temps (la loi de Lucas-Washburn), à une vitesse qui dépend du solvant.
- Des taches et des pics gaussiens, qui s'élargissent avec la distance par diffusion ; de petites quantités, donc pas de surcharge.
- Une colonne de 25 cm, de 4,6 mm de diamètre et 65 % de vide, donc t₀ = 2,7 mL ÷ le débit.
Cas limites
- Rf proche de 0 ou de 1 : les composés s'entassent sur la ligne de dépôt ou au front et on ne peut plus les distinguer. Visez des Rf entre environ 0,2 et 0,8 en choisissant le solvant.
- Solvant au-dessus de la ligne de dépôt : les taches se dissolvent dans le solvant du fond au lieu de migrer.
- Les composés incolores demandent un révélateur (ninhydrine pour les acides aminés, vapeur d'iode, lumière UV sur une plaque fluorescente) pour être vus.
- Un Rf identique ne prouve pas que deux composés sont les mêmes ; éluez-les dans un second solvant, ou côte à côte et mélangés (co-dépôt).
Où le modèle cesse d'être juste
- Traînées et surcharge. Trop d'échantillon, ou des composés acides et basiques sur silice, donnent des traînées et des taches en forme de comète au lieu de cercles nets.
- Les mélanges de solvants se séparent eux-mêmes. La partie la plus polaire d'un mélange est retenue par la plaque, donc la composition du solvant change en montant, et une cuve sèche non saturée laisse le solvant s'évaporer de la plaque pendant qu'il monte ; les deux décalent les Rf.
- La température et l'humidité modifient Rf, et une silice qui a pris l'humidité de l'air devient moins active.
- L'élution en gradient, où le solvant devient peu à peu plus fort pendant une élution sur colonne, est la façon dont se fait l'essentiel de la CLHP ; ce modèle garde le solvant fixe.
- D'autres mécanismes. Les chromatographies d'échange d'ions, d'exclusion stérique et d'affinité séparent selon la charge, la taille et une liaison spécifique, pas selon la polarité.
Outils associés
Le Simulateur d'électrophorèse sur gel sépare l'ADN selon la taille, une autre façon de démêler un mélange ; le Simulateur de spectrophotomètre et de la loi de Beer-Lambert montre comment un détecteur mesure la quantité d'un composé qui sort ; et le Visualiseur de molécules 3D montre les groupes polaires qui font s'accrocher les molécules.