Simulateur de spectrophotomètre et de la loi de Beer-Lambert
Équations de cette simulation
| A | absorbance | sans unité ; chaque unité de A divise la lumière par dix | |
|---|---|---|---|
| T | transmittance | la part de la lumière qui traverse l'échantillon, comparée à un blanc de solvant seul |
Avec les valeurs actuelles :
| ε | coefficient d'absorption à cette longueur d'onde | en M⁻¹ cm⁻¹ pour les sels ; pour la protéine et l'ADN, par mg/mL ou par µg/mL et par cm | |
|---|---|---|---|
| l | Longueur du trajet optique l | la distance que parcourt la lumière dans la solution | |
| c | concentration | d'après Concentration (% de la plage ; la valeur figure dans les résultats) |
Avec les valeurs actuelles :
| m, b | pente et ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage | ajustées par les moindres carrés aux étalons que vous ajoutez ; R² indique à quel point ils sont alignés |
|---|
Avec les valeurs actuelles :
| s | lumière parasite | lumière d'autres longueurs d'onde qui atteint quand même le détecteur ; elle plafonne l'absorbance qu'un appareil peut lire vers −log₁₀ s = 3 |
|---|
Avec les valeurs actuelles :
Comment utiliser le simulateur de spectrophotomètre
- Choisissez une solution, une longueur d’onde et une concentration. Le monochromateur sépare la lumière de la lampe en couleurs, une bande étroite passe par la fente, traverse la cuve et atteint le détecteur, qui lit l’absorbance par rapport à un blanc de solvant seul. Appuyez sur Aller au maximum pour sauter à la longueur d’onde que la solution absorbe le plus.
- Regardez l’absorbance augmenter en proportion de la concentration et du trajet optique, comme le dit la loi de Beer-Lambert, et la couleur de la solution foncer. Le graphique montre le spectre d’absorption complet : la courbe mesurée à côté de la courbe de Beer-Lambert seule. Montez la concentration jusqu’à ce que l’absorbance dépasse 2 ou 3 et que la courbe mesurée s’aplatisse à cause de la lumière parasite ; élargissez la fente sur les pics étroits du permanganate, ou choisissez une cuve en plastique dans l’ultraviolet, pour voir d’autres façons dont les mesures déraillent.
- Construisez une courbe d’étalonnage : réglez plusieurs concentrations et appuyez chaque fois sur Ajouter cette mesure à la courbe d'étalonnage, puis sur Mesurer l'inconnu. La droite ajustée donne sa concentration, et les résultats indiquent aussi sa valeur réelle. Le Calcul de la loi de Beer-Lambert et le Calcul de courbe étalon font la même chose avec vos propres mesures.
Questions fréquentes
Qu’est-ce que la loi de Beer-Lambert ?
A = ε l c : l’absorbance est égale à l’absorptivité de la substance à cette longueur d’onde, multipliée par le trajet de la lumière dans la solution et par la concentration. Comme l’absorbance est logarithmique, A = 1 signifie que 10 % de la lumière passe, et A = 2, 1 %. C’est cette loi qui permet à un spectrophotomètre de mesurer des concentrations.
Pourquoi mesurer au maximum ?
À λmax l’absorbance est la plus grande, donc la mesure est la plus sensible, et la courbe y est plate, de sorte qu’une petite erreur de longueur d’onde ou une fente large changent moins la lecture. C’est pourquoi l’ADN se mesure à 260 nm et les protéines à 280 nm.
Pourquoi l’absorbance doit-elle rester sous 1,5 environ ?
Au-dessus de A = 2, moins de 1 % de la lumière atteint le détecteur, donc la lumière parasite (de la lumière d’autres longueurs d’onde qui passe quand même) et le bruit du détecteur deviennent une grande part de ce qui est mesuré. La lecture plafonne sous la vraie valeur. Diluez l’échantillon et multipliez ensuite.
Pourquoi faut-il une courbe d’étalonnage ?
Les appareils et les solutions réels ne sont pas parfaits, et ε est souvent inconnu pour un échantillon donné. Mesurer des étalons de concentration connue dans les mêmes conditions étalonne l’appareil et vérifie que la réponse est linéaire ; l’inconnu est ensuite lu sur la droite ajustée. Ne vous fiez au résultat qu’à l’intérieur de la plage des étalons.
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