La loi de Beer-Lambert expliquée : absorbance, transmittance, spectres d'absorption et courbes d'étalonnage

Comment fonctionne un spectrophotomètre

Une lampe fournit de la lumière blanche (une lampe au tungstène pour le visible, une lampe au deutérium pour l'ultraviolet). Un monochromateur, un prisme ou un réseau de diffraction avec une fente, sélectionne une bande étroite de longueurs d'onde. Cette lumière traverse l'échantillon dans une cuve et arrive sur un détecteur. On mesure d'abord un blanc, la cuve avec le solvant seul, qui donne I₀ ; puis l'échantillon donne I. Diviser l'un par l'autre élimine la luminosité de la lampe, les reflets de la cuve et l'absorption propre du solvant.

Transmittance et absorbance

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

La transmittance est la part de la lumière qui passe. L'absorbance en est le logarithme négatif, qui transforme la façon dont la lumière s'éteint dans un échantillon, de la même fraction à chaque millimètre, en un nombre qui croît en ligne droite avec la quantité d'espèce absorbante :

A = 0 : toute la lumière passe.
A = 1 : 10 % passent.
A = 2 : 1 %. A = 3 : 0,1 %.

La loi de Beer-Lambert

A = ε l c

ε est le coefficient d'absorption de la substance à cette longueur d'onde : la force avec laquelle elle absorbe. En M⁻¹ cm⁻¹, c'est le coefficient d'absorption molaire, ou coefficient d'extinction.
l est la longueur du trajet optique dans l'échantillon, 1 cm dans une cuve standard.
c est la concentration.

Doublez la concentration ou le trajet et l'absorbance double. La loi permet de convertir directement une absorbance mesurée en concentration quand ε est connu.

Exemples chiffrés

Le permanganate de potassium a ε = 2 455 M⁻¹ cm⁻¹ à 525 nm. Une solution à 80 µM dans une cuve de 1 cm : A = 2 455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10^−0,196 = 63,7 %.
Protéine : la sérumalbumine bovine absorbe 0,667 par mg/mL et par cm à 280 nm, grâce à son tryptophane et à sa tyrosine. Une lecture de 0,40 signifie 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL.
ADN : l'ADN double brin à 50 µg/mL donne A₂₆₀ = 1,0. Un échantillon dilué au dixième qui lit 0,25 contient 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. L'ADN pur a un rapport A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ d'environ 1,8 ; un rapport plus bas suggère la présence de protéines.

Les spectres d'absorption

Tracer l'absorbance en fonction de la longueur d'onde donne le spectre d'absorption de la substance. Mesurez à son maximum, λ_max : la lecture y est la plus forte, donc la plus sensible, et la courbe y est plate, si bien que de petites erreurs de longueur d'onde comptent le moins. Une solution a la couleur de la lumière qu'elle n'absorbe pas : le permanganate absorbe le vert (vers 525 nm) et paraît violet ; le sulfate de cuivre absorbe le rouge et le proche infrarouge (vers 800 nm) et paraît bleu pâle.

Les courbes d'étalonnage

Souvent, ε n'est pas connu pour l'échantillon et les conditions exactes, ou l'appareil doit être vérifié. On mesure alors une série d'étalons de concentration connue, on trace l'absorbance en fonction de la concentration et on ajuste une droite A = m c + b. La concentration d'un inconnu est c = (A − b) ÷ m.

Exemple : des étalons de permanganate à 0, 25, 50 et 100 µM lisent 0,000, 0,061, 0,123 et 0,245. La pente ajustée est de 0,00245 par µM, avec une ordonnée à l'origine proche de zéro. Un inconnu qui lit 0,150 contient 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM. Ne vous fiez au résultat qu'à l'intérieur de la plage des étalons, et seulement si R² est proche de 1.

Utiliser la simulation

Dans le Simulateur de spectrophotomètre et de la loi de Beer-Lambert, à essayer :

Le permanganate à son maximum : doublez la concentration et l'absorbance double, tandis que la transmittance passe de 64 % à 41 %.
Divisez le trajet optique par deux : l'absorbance est divisée par deux.
Poussez la concentration au maximum : l'absorbance mesurée passe sous la droite de Beer-Lambert et plafonne vers 3 à cause de la lumière parasite. Décochez Inclure 0,1 % de lumière parasite et les deux coïncident.
Élargissez la fente à 20 nm sur les pics étroits du permanganate : l'absorbance au maximum baisse et le spectre se lisse.
Choisissez l'ADN à 260 nm dans une cuve en plastique : la cuve absorbe presque tout l'ultraviolet et la lecture n'est plus que du bruit.
Ajoutez quatre étalons, mesurez l'inconnu et comparez le résultat à la valeur réelle affichée.

Ce que le modèle suppose

Des spectres d'absorption faits de pics lisses, mis à l'échelle sur des valeurs publiées à une longueur d'onde : permanganate 2 455 M⁻¹ cm⁻¹ à 525 nm, sulfate de cuivre environ 12,5 M⁻¹ cm⁻¹ à 810 nm, albumine 0,667 par mg/mL à 280 nm, ADN 0,020 par µg/mL à 260 nm. Les formes ailleurs sont approximatives.
Une bande de fente triangulaire : la lecture fait la moyenne de la transmittance sur ± la largeur de fente.
Une lumière parasite de 0,1 % qui atteint le détecteur sans traverser l'espèce absorbante à la longueur d'onde choisie.
Les cuves : le quartz transmet partout à partir de 200 nm ; le polystyrène ne transmet plus en dessous d'environ 300 nm.
Un peu de bruit du détecteur, si bien que les lectures fluctuent sur le dernier chiffre et deviennent peu fiables quand presque aucune lumière ne passe.
Le blanc annule exactement la cuve et le solvant, et l'inconnu reçoit une nouvelle concentration aléatoire pour chaque solution après Réinitialiser.

Cas limites

Une concentration nulle donne A = 0, au bruit près, parce que le blanc est la même cuve avec le même solvant.
Les longueurs d'onde où rien n'absorbe donnent A ≈ 0 à toute concentration ; le sulfate de cuivre n'absorbe presque pas dans le vert.
Une absorbance très élevée atteint un plafond proche de −log₁₀ de la lumière parasite : environ 3 pour 0,1 %.
Des étalons à une longueur d'onde et l'inconnu à une autre donnent un résultat sans signification ; la simulation le signale.

Où le modèle cesse d'être juste

Les solutions concentrées. Au-delà d'environ 10 mM, les molécules sont assez proches pour modifier l'absorption des autres, et l'indice de réfraction change ; la droite s'incurve même avec un appareil parfait.
La chimie dans la cuve. Les colorants qui s'associent par paires, les acides et bases dont la couleur dépend du pH et les complexes qui se dissocient à la dilution font tous varier ε avec la concentration.
La diffusion. Les échantillons troubles, les cellules et les précipités dévient la lumière hors du détecteur, ce qui se lit comme une absorbance qui n'existe pas ; c'est précisément ce que mesure volontairement la DO600 d'une culture bactérienne.
La fluorescence. Un échantillon qui réémet une partie de la lumière peut l'envoyer vers le détecteur et donner une lecture trop basse.
Les protéines diffèrent. La valeur 0,667 vaut pour l'albumine ; d'autres protéines contiennent d'autres quantités de tryptophane et de tyrosine et peuvent absorber moitié moins ou deux fois plus par mg/mL.

Calculateurs

Résolvez A = εlc pour n'importe quel terme avec le Calcul de la loi de Beer-Lambert, ajustez vos propres mesures avec le Calcul de courbe étalon, et calculez des concentrations d'acides nucléiques et de protéines avec le Calcul de concentration d’ADN et le Calcul de la concentration en protéines (A280). Les guides Faire une courbe étalon et Mesurer la concentration en protéines à 280 nm vont plus loin.

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