A lei de Beer-Lambert explicada: absorbância, espectrofotômetros e curvas padrão

Como funciona um espectrofotômetro

Uma lâmpada fornece luz branca (uma lâmpada de tungstênio para o visível, uma de deutério para o ultravioleta). Um monocromador, um prisma ou uma rede de difração com uma fenda, escolhe uma faixa estreita de comprimentos de onda. Essa luz atravessa a amostra numa cubeta e chega a um detector. Primeiro se mede um branco, a cubeta só com o solvente, que dá I₀; depois a amostra dá I. Dividir um pelo outro cancela o brilho da lâmpada, os reflexos da cubeta e a absorção do próprio solvente.

Transmitância e absorbância

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

A transmitância é a fração da luz que passa. A absorbância é o seu logaritmo negativo, que transforma o modo como a luz se apaga numa amostra, pela mesma fração a cada milímetro, num número que cresce em linha reta com a quantidade de substância que absorve:

• A = 0: toda a luz passa.
• A = 1: passam 10 %.
• A = 2: 1 %. A = 3: 0,1 %.

A lei de Beer-Lambert

A = ε l c

• ε é a absortividade da substância naquele comprimento de onda: o quanto ela absorve. Em M⁻¹ cm⁻¹, é a absortividade molar, ou coeficiente de extinção.
• l é o caminho óptico pela amostra, 1 cm numa cubeta padrão.
• c é a concentração.

Dobre a concentração ou o caminho e a absorbância dobra. A lei permite transformar uma absorbância medida diretamente numa concentração quando ε é conhecido.

Exemplos resolvidos

1. O permanganato de potássio tem ε = 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ a 525 nm. Uma solução de 80 µM numa cubeta de 1 cm: A = 2.455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10^−0,196 = 63,7 %.
2. Proteína: a albumina de soro bovino absorve 0,667 por mg/mL por cm a 280 nm, por causa do triptofano e da tirosina. Uma leitura de 0,40 significa 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL.
3. DNA: DNA de fita dupla a 50 µg/mL dá A₂₆₀ = 1,0. Uma amostra diluída 1 para 10 que lê 0,25 contém 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. DNA puro tem A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ de cerca de 1,8; uma razão menor sugere proteína na amostra.

Espectros de absorção

Traçar a absorbância contra o comprimento de onda dá o espectro de absorção da substância. Meça no pico, λ_max: a leitura é a maior, portanto a mais sensível, e a curva é plana ali, então pequenos erros de comprimento de onda pesam menos. Uma solução tem a cor da luz que ela não absorve: o permanganato absorve o verde (por volta de 525 nm) e parece roxo; o sulfato de cobre absorve o vermelho e o infravermelho próximo (por volta de 800 nm) e parece azul-claro.

Curvas padrão

Muitas vezes ε não é conhecido para a amostra e as condições exatas, ou o aparelho precisa ser conferido. Então se mede uma série de padrões de concentração conhecida, traça-se a absorbância contra a concentração e ajusta-se uma reta A = m c + b. A concentração de uma desconhecida é c = (A − b) ÷ m.

Exemplo: padrões de permanganato de 0, 25, 50 e 100 µM leem 0,000, 0,061, 0,123 e 0,245. A inclinação ajustada é 0,00245 por µM, com intercepto perto de zero. Uma desconhecida que lê 0,150 tem 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM. Confie no resultado só dentro da faixa dos padrões, e só se R² estiver perto de 1.

Como usar a simulação

No Simulador de espectrofotômetro e lei de Beer-Lambert, experimente:

• Permanganato no pico: dobre a concentração e a absorbância dobra, enquanto a transmitância cai de 64 % para 41 %.
• Reduza o caminho óptico à metade: a absorbância cai à metade.
• Leve a concentração ao máximo: a absorbância medida fica abaixo da reta de Beer-Lambert e achata perto de 3 por causa da luz espúria. Desmarque Incluir 0,1% de luz espúria e as duas coincidem.
• Abra a fenda para 20 nm nos picos estreitos do permanganato: a absorbância do pico cai e o espectro fica mais suave.
• Escolha DNA a 260 nm numa cubeta de plástico: a cubeta absorve quase todo o ultravioleta e a leitura vira ruído.
• Adicione quatro padrões, meça a desconhecida e compare o resultado com o valor real mostrado.

O que o modelo supõe

• Espectros de absorção construídos com picos suaves, escalados para valores publicados num comprimento de onda: permanganato 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ a 525 nm, sulfato de cobre cerca de 12,5 M⁻¹ cm⁻¹ a 810 nm, albumina 0,667 por mg/mL a 280 nm, DNA 0,020 por µg/mL a 260 nm. As formas em outras regiões são aproximadas.
• Uma faixa de fenda triangular: a leitura faz a média da transmitância em ± a largura da fenda.
• Luz espúria de 0,1 % que chega ao detector sem passar pela substância no comprimento de onda escolhido.
• Cubetas: o quartzo transmite em toda a faixa a partir de 200 nm; o poliestireno deixa de transmitir abaixo de cerca de 300 nm.
• Um pouco de ruído no detector, então as leituras oscilam no último dígito e ficam pouco confiáveis quando quase nenhuma luz passa.
• O branco cancela exatamente a cubeta e o solvente, e a desconhecida ganha uma nova concentração aleatória para cada solução depois de Reiniciar.

Casos-limite

• Concentração zero dá A = 0, a não ser pelo ruído, porque o branco é a mesma cubeta com o mesmo solvente.
• Comprimentos de onda onde nada absorve dão A ≈ 0 em qualquer concentração; o sulfato de cobre quase não absorve no verde.
• Absorbância muito alta chega a um teto perto de −log₁₀ da luz espúria: cerca de 3 para 0,1 %.
• Padrões num comprimento de onda e a desconhecida em outro dão um resultado sem sentido; a simulação avisa.

Onde o modelo deixa de valer

• Soluções concentradas. Acima de cerca de 10 mM, as moléculas ficam perto o bastante para afetar a absorção umas das outras, e o índice de refração muda; a reta se curva mesmo com um aparelho perfeito.
• Química na cubeta. Corantes que se emparelham, ácidos e bases cuja cor depende do pH e complexos que se dissociam ao diluir mudam todos o ε com a concentração.
• Espalhamento. Amostras turvas, células e precipitados desviam a luz para longe do detector, o que aparece como uma absorbância que não existe; é exatamente o que a DO600 de uma cultura bacteriana mede de propósito.
• Fluorescência. Uma amostra que reemite parte da luz pode mandá-la para o detector e dar uma leitura baixa.
• As proteínas são diferentes. O valor 0,667 é da albumina; outras proteínas têm quantidades diferentes de triptofano e tirosina e podem absorver metade ou o dobro por mg/mL.

Calculadoras

Resolva A = εlc para qualquer termo com a Calculadora da lei de Beer-Lambert, ajuste suas próprias leituras com a Calculadora de curva padrão e calcule concentrações de ácidos nucleicos e proteínas com a Calculadora de concentração de DNA e a Calculadora de concentração de proteínas (A280). Os guias Como fazer uma curva padrão e Como medir a concentração de proteínas a A280 vão além.