비어-람베르트 법칙 해설: 흡광도, 투과율, 흡수 스펙트럼과 검량선

분광 광도계의 원리

램프가 백색광을 냅니다(가시광에는 텅스텐 램프, 자외선에는 중수소 램프). 단색화 장치, 곧 슬릿이 달린 프리즘이나 회절 격자가 좁은 파장 띠를 골라냅니다. 그 빛이 큐벳 속 시료를 지나 검출기에 닿습니다. 먼저 용매만 든 큐벳, 곧 바탕 용액을 재서 I₀를 얻고, 다음에 시료를 재서 I를 얻습니다. 하나를 다른 하나로 나누면 램프 밝기, 큐벳의 반사, 용매 자체의 흡수가 상쇄됩니다.

투과율과 흡광도

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

투과율은 통과한 빛의 비율입니다. 흡광도는 그 로그에 음의 부호를 붙인 것으로, 시료 속에서 1 mm마다 같은 비율로 빛이 약해지는 모습을, 흡수하는 물질의 양에 비례해 직선으로 커지는 수로 바꿉니다.

A = 0: 빛이 모두 통과합니다.
A = 1: 10%가 통과합니다.
A = 2: 1%. A = 3: 0.1%.

비어-람베르트 법칙

A = ε l c

ε는 그 파장에서 물질의 흡광 계수로, 얼마나 세게 흡수하는지를 나타냅니다. M⁻¹ cm⁻¹ 단위로 쓰면 몰 흡광 계수입니다.
l은 시료를 지나는 광로 길이로, 표준 큐벳에서는 1 cm입니다.
c는 농도입니다.

농도나 광로를 두 배로 하면 흡광도도 두 배가 됩니다. ε를 알면 이 법칙으로 잰 흡광도를 곧바로 농도로 바꿀 수 있습니다.

계산 예

과망가니즈산 칼륨은 525 nm에서 ε = 2,455 M⁻¹ cm⁻¹입니다. 80 µM 용액을 1 cm 큐벳에서 재면 A = 2,455 × 1 × 0.000080 = 0.196, T = 10^−0.196 = 63.7%입니다.
단백질: 소 혈청 알부민은 트립토판과 타이로신 덕분에 280 nm에서 1 mg/mL·1 cm당 0.667을 흡수합니다. 측정값이 0.40이면 0.40 ÷ 0.667 = 0.60 mg/mL입니다.
DNA: 이중 가닥 DNA는 50 µg/mL에서 A₂₆₀ = 1.0입니다. 10배 희석해서 0.25가 나온 시료에는 0.25 × 50 × 10 = 125 µg/mL가 들어 있습니다. 순수한 DNA의 A₂₆₀ ÷ A₂₈₀은 약 1.8이고, 이보다 낮으면 단백질이 섞였을 수 있습니다.

흡수 스펙트럼

흡광도를 파장에 대해 그리면 그 물질의 흡수 스펙트럼이 됩니다. 측정은 봉우리 λ_max에서 합니다. 그곳에서 측정값이 가장 커서 가장 민감하고, 곡선이 평평해서 파장의 작은 오차가 가장 적게 영향을 줍니다. 용액은 흡수하지 않는 빛의 색으로 보입니다. 과망가니즈산은 초록(약 525 nm)을 흡수해 보라색으로 보이고, 황산 구리는 빨강과 근적외선(약 800 nm)을 흡수해 연한 파란색으로 보입니다.

검량선

그 시료와 조건에서의 ε를 모르거나 기기를 점검해야 할 때가 많습니다. 그럴 때는 농도를 아는 표준 용액을 여러 개 재고, 흡광도를 농도에 대해 그려 직선 A = m c + b를 맞춥니다. 미지 시료의 농도는 c = (A − b) ÷ m입니다.

예: 0, 25, 50, 100 µM 과망가니즈산 표준 용액이 0.000, 0.061, 0.123, 0.245로 읽혔습니다. 맞춘 기울기는 µM당 0.00245이고 절편은 0에 가깝습니다. 0.150으로 읽힌 미지 시료는 0.150 ÷ 0.00245 = 61 µM입니다. 결과는 표준 용액 범위 안에서, 그리고 R²가 1에 가까울 때만 믿으세요.

시뮬레이션 사용법

분광 광도계와 비어-람베르트 법칙 시뮬레이터에서 해 볼 만한 것:

과망가니즈산을 봉우리에서 재기: 농도를 두 배로 하면 흡광도가 두 배가 되고, 투과율은 64%에서 41%로 떨어집니다.
광로 길이를 절반으로 하기: 흡광도가 절반이 됩니다.
농도를 끝까지 올리기: 측정한 흡광도가 비어-람베르트 직선 아래로 처지고 미광 때문에 3 근처에서 평평해집니다. 0.1% 미광 포함 체크를 풀면 둘이 일치합니다.
과망가니즈산의 좁은 봉우리에서 슬릿을 20 nm로 넓히기: 봉우리 흡광도가 낮아지고 스펙트럼이 매끈해집니다.
DNA를 260 nm, 플라스틱 큐벳으로 재기: 큐벳이 자외선을 거의 다 흡수해 측정값이 잡음이 됩니다.
표준 용액 네 개를 추가하고 미지 시료를 잰 뒤, 결과를 표시된 실제 값과 비교하기.

모형의 가정

매끈한 봉우리로 만든 흡수 스펙트럼을 한 파장에서 발표된 값에 맞춰 조정했습니다. 과망가니즈산은 525 nm에서 2,455 M⁻¹ cm⁻¹, 황산 구리는 810 nm에서 약 12.5 M⁻¹ cm⁻¹, 알부민은 280 nm에서 mg/mL당 0.667, DNA는 260 nm에서 µg/mL당 0.020입니다. 다른 파장에서의 모양은 근사입니다.
삼각형 슬릿 띠: 측정값은 슬릿 폭의 ± 범위에서 투과율을 평균한 것입니다.
0.1%의 미광이 고른 파장에서 흡수 물질을 지나지 않고 검출기에 닿습니다.
큐벳: 석영은 200 nm 이상 모든 파장을 통과시키고, 폴리스타이렌은 약 300 nm 아래에서 빛을 통과시키지 못합니다.
약간의 검출기 잡음이 있어 측정값이 마지막 자리에서 흔들리고, 빛이 거의 통과하지 않으면 믿을 수 없게 됩니다.
바탕 용액이 큐벳과 용매를 정확히 상쇄하고, 미지 시료는 초기화할 때마다 용액별로 새 무작위 농도를 받습니다.

경계 사례

농도 0은 바탕 용액과 같은 큐벳, 같은 용매이므로 잡음을 빼면 A = 0으로 읽힙니다.
아무것도 흡수하지 않는 파장에서는 어떤 농도에서도 A ≈ 0입니다. 황산 구리는 초록 빛을 거의 흡수하지 않습니다.
매우 높은 흡광도는 미광의 −log₁₀ 근처, 0.1%라면 약 3에서 상한에 닿습니다.
표준 용액은 한 파장에서, 미지 시료는 다른 파장에서 재면 의미 없는 결과가 나옵니다. 시뮬레이션이 경고합니다.

모형이 맞지 않게 되는 경우

진한 용액. 약 10 mM을 넘으면 분자들이 가까워져 서로의 흡수에 영향을 주고 굴절률도 바뀝니다. 기기가 완벽해도 직선이 휩니다.
큐벳 속의 화학. 짝을 이루는 염료, pH에 따라 색이 바뀌는 산과 염기, 희석하면 해리되는 착물은 모두 농도에 따라 ε가 바뀝니다.
산란. 탁한 시료, 세포, 침전물은 빛을 검출기 밖으로 흩어 실제로는 없는 흡광도처럼 읽힙니다. 세균 배양의 OD600은 바로 이것을 일부러 잽니다.
형광. 빛의 일부를 다시 내보내는 시료는 그 빛을 검출기로 보내 측정값이 낮게 나올 수 있습니다.
단백질마다 다릅니다. 0.667은 알부민의 값입니다. 다른 단백질은 트립토판과 타이로신의 양이 달라 mg/mL당 흡수가 절반이거나 두 배일 수 있습니다.

계산기

비어-람베르트 법칙으로 A = εlc를 어느 항에 대해서든 풀고, 직접 잰 값은 표준 곡선 계산기로 맞추며, 핵산과 단백질 농도는 DNA 농도 계산기와 단백질 농도 계산기(A280)로 구하세요. 가이드 표준 곡선 만드는 방법과 A280으로 단백질 농도 측정하는 방법에서 더 자세히 다룹니다.

비어-람베르트 법칙 해설: 흡광도, 분광 광도계, 검량선