Hukum Beer-Lambert: Absorbansi, Spektrofotometer, dan Kurva Standar

Cara kerja spektrofotometer

Lampu memberi cahaya putih (lampu tungsten untuk cahaya tampak, lampu deuterium untuk ultraungu). Monokromator, yaitu prisma atau kisi difraksi dengan celah, memilih pita panjang gelombang yang sempit. Cahaya itu menembus sampel di dalam kuvet dan jatuh ke detektor. Pertama diukur blanko, kuvet berisi pelarut saja, yang memberi I₀; lalu sampel memberi I. Membagi yang satu dengan yang lain menghapus kecerahan lampu, pantulan kuvet, dan serapan pelarut itu sendiri.

Transmitansi dan absorbansi

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

Transmitansi adalah bagian cahaya yang lolos. Absorbansi adalah logaritma negatifnya, yang mengubah cara cahaya meredup di dalam sampel, dengan bagian yang sama di setiap milimeter, menjadi angka yang naik lurus sebanding dengan jumlah zat penyerap:

• A = 0: semua cahaya lolos.
• A = 1: 10% lolos.
• A = 2: 1%. A = 3: 0,1%.

Hukum Beer-Lambert

A = ε l c

• ε adalah absorptivitas zat pada panjang gelombang itu: seberapa kuat zat menyerap. Dalam M⁻¹ cm⁻¹ ini disebut absorptivitas molar atau koefisien ekstingsi.
• l adalah panjang lintasan melalui sampel, 1 cm pada kuvet standar.
• c adalah konsentrasi.

Gandakan konsentrasi atau lintasan, maka absorbansi berlipat dua. Hukum ini memungkinkan absorbansi terukur langsung diubah menjadi konsentrasi bila ε diketahui.

Contoh perhitungan

1. Kalium permanganat punya ε = 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ pada 525 nm. Larutan 80 µM dalam kuvet 1 cm: A = 2.455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10^−0,196 = 63,7%.
2. Protein: albumin serum sapi menyerap 0,667 per mg/mL per cm pada 280 nm, berkat triptofan dan tirosinnya. Bacaan 0,40 berarti 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL.
3. DNA: DNA untai ganda pada 50 µg/mL memberi A₂₆₀ = 1,0. Sampel yang diencerkan 1 banding 10 dan terbaca 0,25 berisi 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. DNA murni punya A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ sekitar 1,8; rasio yang lebih rendah menandakan ada protein di dalamnya.

Spektrum serapan

Memetakan absorbansi terhadap panjang gelombang memberi spektrum serapan zat itu. Ukur di puncaknya, λ_max: bacaannya paling besar sehingga paling peka, dan kurvanya datar di sana sehingga kesalahan kecil pada panjang gelombang paling sedikit berpengaruh. Larutan tampak berwarna seperti cahaya yang tidak diserapnya: permanganat menyerap hijau (sekitar 525 nm) dan tampak ungu; tembaga sulfat menyerap merah dan inframerah dekat (sekitar 800 nm) dan tampak biru pucat.

Kurva standar

Sering kali ε tidak diketahui untuk sampel dan kondisi yang tepat, atau alatnya perlu diperiksa. Maka serangkaian standar dengan konsentrasi yang diketahui diukur, absorbansi dipetakan terhadap konsentrasi, dan garis lurus A = m c + b dicocokkan. Konsentrasi sampel yang tidak diketahui adalah c = (A − b) ÷ m.

Contoh: standar permanganat 0, 25, 50, dan 100 µM terbaca 0,000, 0,061, 0,123, dan 0,245. Kemiringan hasil pencocokan 0,00245 per µM dengan titik potong mendekati nol. Sampel yang terbaca 0,150 berarti 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM. Percayai hasilnya hanya di dalam rentang standar, dan hanya jika R² mendekati 1.

Memakai simulasi

Di Simulator Spektrofotometer dan Hukum Beer-Lambert, hal yang bisa dicoba:

• Permanganat di puncaknya: gandakan konsentrasi dan absorbansi berlipat dua, sementara transmitansi turun dari 64% menjadi 41%.
• Bagi dua panjang lintasan: absorbansi menjadi setengahnya.
• Naikkan konsentrasi sampai maksimum: absorbansi terukur jatuh di bawah garis Beer-Lambert dan mendatar di sekitar 3 karena cahaya sesat. Hapus centang Sertakan 0,1% cahaya sesat dan keduanya sama.
• Lebarkan celah menjadi 20 nm pada puncak-puncak sempit permanganat: absorbansi puncak turun dan spektrumnya menjadi halus.
• Pilih DNA pada 260 nm dalam kuvet plastik: kuvet menyerap hampir semua ultraungu dan bacaannya menjadi derau.
• Tambahkan empat standar, ukur sampel yang tidak diketahui, dan bandingkan hasilnya dengan nilai sebenarnya yang ditampilkan.

Asumsi model

• Spektrum serapan yang disusun dari puncak-puncak halus, diskalakan ke nilai yang diterbitkan pada satu panjang gelombang: permanganat 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ pada 525 nm, tembaga sulfat sekitar 12,5 M⁻¹ cm⁻¹ pada 810 nm, albumin 0,667 per mg/mL pada 280 nm, DNA 0,020 per µg/mL pada 260 nm. Bentuk di tempat lain hanya perkiraan.
• Pita celah berbentuk segitiga: bacaannya merata-ratakan transmitansi sebesar ± lebar celah.
• Cahaya sesat 0,1% yang mencapai detektor tanpa melewati zat penyerap pada panjang gelombang yang dipilih.
• Kuvet: kuarsa meneruskan cahaya di semua panjang gelombang mulai 200 nm; polistirena tidak lagi meneruskan di bawah sekitar 300 nm.
• Sedikit derau detektor, sehingga bacaan bergoyang di digit terakhir dan menjadi tidak andal saat hampir tidak ada cahaya yang lolos.
• Blanko menghapus kuvet dan pelarut dengan tepat, dan sampel yang tidak diketahui mendapat konsentrasi acak baru untuk setiap larutan setelah Atur ulang.

Kasus batas

• Konsentrasi nol terbaca A = 0, kecuali derau, karena blankonya kuvet dan pelarut yang sama.
• Panjang gelombang yang tidak diserap apa pun memberi A ≈ 0 pada konsentrasi berapa pun; tembaga sulfat hampir tidak menyerap di daerah hijau.
• Absorbansi yang sangat tinggi mencapai batas atas di sekitar −log₁₀ cahaya sesat: sekitar 3 untuk 0,1%.
• Standar pada satu panjang gelombang dan sampel pada panjang gelombang lain memberi hasil yang tidak bermakna; simulasi memperingatkannya.

Di mana model tidak lagi berlaku

• Larutan pekat. Di atas sekitar 10 mM, molekul cukup berdekatan untuk memengaruhi serapan satu sama lain, dan indeks biasnya berubah; garisnya melengkung bahkan dengan alat yang sempurna.
• Kimia di dalam kuvet. Zat warna yang berpasangan, asam dan basa yang warnanya bergantung pada pH, dan kompleks yang terurai saat diencerkan semuanya mengubah ε seiring konsentrasi.
• Hamburan. Sampel keruh, sel, dan endapan menghamburkan cahaya menjauhi detektor, yang terbaca sebagai absorbansi yang sebenarnya tidak ada; inilah yang sengaja diukur oleh OD600 kultur bakteri.
• Fluoresensi. Sampel yang memancarkan kembali sebagian cahaya bisa mengirimkannya ke detektor dan terbaca terlalu rendah.
• Protein berbeda-beda. Angka 0,667 berlaku untuk albumin; protein lain punya jumlah triptofan dan tirosin yang berbeda dan bisa menyerap setengah atau dua kali lipat per mg/mL.

Kalkulator

Selesaikan A = εlc untuk suku mana pun dengan Kalkulator Hukum Beer-Lambert, cocokkan bacaanmu sendiri dengan Kalkulator Kurva Standar, dan hitung konsentrasi asam nukleat dan protein dengan Kalkulator Konsentrasi DNA dan Kalkulator Konsentrasi Protein (A280). Panduan Cara Membuat Kurva Standar dan Cara Mengukur Konsentrasi Protein pada A280 membahas lebih jauh.