बियर-लैम्बर्ट नियम समझें: अवशोषकता, स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर और मानक वक्र

स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर कैसे काम करता है

एक लैंप सफ़ेद प्रकाश देता है (दृश्य प्रकाश के लिए टंगस्टन लैंप, पराबैंगनी के लिए ड्यूटेरियम लैंप)। एक मोनोक्रोमेटर, यानी स्लिट के साथ प्रिज़्म या विवर्तन ग्रेटिंग, तरंगदैर्ध्यों की एक संकरी पट्टी चुनता है। वह प्रकाश क्यूवेट में रखे नमूने से गुज़रकर डिटेक्टर पर पड़ता है। पहले एक ब्लैंक नापा जाता है, यानी सिर्फ़ विलायक वाला क्यूवेट, जो I₀ देता है; फिर नमूना I देता है। एक को दूसरे से भाग देने पर लैंप की चमक, क्यूवेट के परावर्तन और विलायक का अपना अवशोषण कट जाते हैं।

पारगम्यता और अवशोषकता

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

पारगम्यता प्रकाश का वह हिस्सा है जो पार हो जाता है। अवशोषकता उसका ऋणात्मक लघुगणक है, जो नमूने में प्रकाश के मंद होने के ढंग को, हर मिलीमीटर में उसी अंश से, एक ऐसी संख्या में बदल देता है जो अवशोषक की मात्रा के साथ सीधी रेखा में बढ़ती है:

• A = 0: सारा प्रकाश पार होता है।
• A = 1: 10% पार होता है।
• A = 2: 1%। A = 3: 0.1%।

बियर-लैम्बर्ट नियम

A = ε l c

• ε उस तरंगदैर्ध्य पर पदार्थ की अवशोषण क्षमता है: वह कितनी ज़ोर से सोखता है। M⁻¹ cm⁻¹ में यह मोलर अवशोषण गुणांक, या विलोपन गुणांक, है।
• l नमूने में पथ लंबाई है, मानक क्यूवेट में 1 cm।
• c सांद्रता है।

सांद्रता या पथ दोगुना करें तो अवशोषकता दोगुनी हो जाती है। ε पता हो तो यह नियम नापी गई अवशोषकता को सीधे सांद्रता में बदलने देता है।

हल किए उदाहरण

1. पोटैशियम परमैंगनेट का 525 nm पर ε = 2,455 M⁻¹ cm⁻¹ है। 1 cm के क्यूवेट में 80 µM का विलयन: A = 2,455 × 1 × 0.000080 = 0.196, T = 10^−0.196 = 63.7%।
2. प्रोटीन: गोजातीय सीरम ऐल्ब्यूमिन अपने ट्रिप्टोफ़ैन और टायरोसीन के कारण 280 nm पर प्रति mg/mL प्रति cm 0.667 सोखता है। 0.40 का पाठ मतलब 0.40 ÷ 0.667 = 0.60 mg/mL।
3. DNA: 50 µg/mL पर द्विरज्जुकी DNA A₂₆₀ = 1.0 देता है। 10 में 1 तनु किया गया नमूना जो 0.25 पढ़ता है, उसमें 0.25 × 50 × 10 = 125 µg/mL है। शुद्ध DNA का A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ लगभग 1.8 होता है; कम अनुपात उसमें प्रोटीन होने का संकेत है।

अवशोषण स्पेक्ट्रम

तरंगदैर्ध्य के सामने अवशोषकता का ग्राफ़ पदार्थ का अवशोषण स्पेक्ट्रम देता है। उसके शिखर λ_max पर नापें: वहाँ पाठ सबसे बड़ा, इसलिए सबसे संवेदनशील होता है, और वक्र सपाट होता है, इसलिए तरंगदैर्ध्य की छोटी गलतियाँ सबसे कम मायने रखती हैं। विलयन उस प्रकाश के रंग का दिखता है जिसे वह नहीं सोखता: परमैंगनेट हरा (लगभग 525 nm) सोखता है और बैंगनी दिखता है; कॉपर सल्फ़ेट लाल और निकट अवरक्त (लगभग 800 nm) सोखता है और हल्का नीला दिखता है।

मानक वक्र

अक्सर ठीक उसी नमूने और हालात के लिए ε पता नहीं होता, या उपकरण की जाँच ज़रूरी होती है। तब ज्ञात सांद्रता वाले मानकों की एक शृंखला नापी जाती है, सांद्रता के सामने अवशोषकता का ग्राफ़ बनाया जाता है और एक सीधी रेखा A = m c + b फ़िट की जाती है। अज्ञात की सांद्रता c = (A − b) ÷ m है।

उदाहरण: 0, 25, 50 और 100 µM के परमैंगनेट मानक 0.000, 0.061, 0.123 और 0.245 पढ़ते हैं। फ़िट की गई ढलान 0.00245 प्रति µM है और अंतःखंड शून्य के पास। 0.150 पढ़ने वाला अज्ञात 0.150 ÷ 0.00245 = 61 µM है। परिणाम पर सिर्फ़ मानकों की सीमा के अंदर भरोसा करें, और सिर्फ़ तब जब R² 1 के पास हो।

सिम्युलेशन का उपयोग

स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर और बियर-लैम्बर्ट नियम सिम्युलेटर में आज़माने के लिए:

• शिखर पर परमैंगनेट: सांद्रता दोगुनी करें तो अवशोषकता दोगुनी होती है, जबकि पारगम्यता 64% से 41% पर गिरती है।
• पथ लंबाई आधी करें: अवशोषकता आधी हो जाती है।
• सांद्रता सबसे ऊपर ले जाएँ: नापी गई अवशोषकता बियर-लैम्बर्ट रेखा से नीचे गिरती है और भटके प्रकाश के कारण 3 के पास चपटी हो जाती है। 0.1% भटका प्रकाश शामिल करें हटाएँ तो दोनों मिल जाते हैं।
• परमैंगनेट के संकरे शिखरों पर स्लिट 20 nm तक चौड़ी करें: शिखर की अवशोषकता गिरती है और स्पेक्ट्रम चिकना हो जाता है।
• प्लास्टिक क्यूवेट में 260 nm पर DNA चुनें: क्यूवेट लगभग सारा पराबैंगनी सोख लेता है और पाठ सिर्फ़ शोर रह जाता है।
• चार मानक जोड़ें, अज्ञात नापें, और परिणाम की तुलना दिखाए गए असली मान से करें।

मॉडल क्या मानकर चलता है

• चिकने शिखरों से बने अवशोषण स्पेक्ट्रम, एक तरंगदैर्ध्य पर प्रकाशित मानों के अनुसार पैमाना किए गए: परमैंगनेट 525 nm पर 2,455 M⁻¹ cm⁻¹, कॉपर सल्फ़ेट 810 nm पर लगभग 12.5 M⁻¹ cm⁻¹, ऐल्ब्यूमिन 280 nm पर 0.667 प्रति mg/mL, DNA 260 nm पर 0.020 प्रति µg/mL। बाक़ी जगह आकार अनुमानित हैं।
• त्रिकोणीय स्लिट पट्टी: पाठ स्लिट चौड़ाई के ± में पारगम्यता का औसत लेता है।
• 0.1% भटका प्रकाश जो चुनी गई तरंगदैर्ध्य पर अवशोषक से गुज़रे बिना डिटेक्टर तक पहुँचता है।
• क्यूवेट: क्वार्ट्ज़ 200 nm से हर जगह प्रकाश पार करता है; पॉलीस्टाइरीन लगभग 300 nm से नीचे प्रकाश पार नहीं करता।
• थोड़ा डिटेक्टर शोर, इसलिए पाठ आख़िरी अंक में डोलते हैं और जब लगभग कोई प्रकाश पार नहीं होता तो अविश्वसनीय हो जाते हैं।
• ब्लैंक क्यूवेट और विलायक को ठीक-ठीक काट देता है, और रीसेट करें के बाद हर विलयन के लिए अज्ञात को एक नई यादृच्छिक सांद्रता मिलती है।

सीमांत स्थितियाँ

• शून्य सांद्रता शोर को छोड़कर A = 0 पढ़ती है, क्योंकि ब्लैंक वही क्यूवेट और विलायक है।
• जिन तरंगदैर्ध्यों पर कुछ नहीं सोखता, वहाँ किसी भी सांद्रता पर A ≈ 0 आता है; कॉपर सल्फ़ेट हरे में मुश्किल से सोखता है।
• बहुत ऊँची अवशोषकता भटके प्रकाश के −log₁₀ के पास एक छत पर पहुँचती है: 0.1% के लिए लगभग 3।
• मानक एक तरंगदैर्ध्य पर, अज्ञात दूसरी पर, अर्थहीन परिणाम देते हैं; सिम्युलेशन चेतावनी देता है।

मॉडल कहाँ सही नहीं रहता

• सांद्र विलयन। लगभग 10 mM से ऊपर अणु इतने पास होते हैं कि एक-दूसरे के अवशोषण पर असर डालते हैं, और अपवर्तनांक बदलता है; पूर्ण उपकरण के साथ भी रेखा मुड़ जाती है।
• क्यूवेट में रसायन। जोड़ी बनाने वाले रंजक, ऐसे अम्ल और क्षार जिनका रंग pH पर निर्भर है, और तनु करने पर टूटने वाले संकुल, सभी सांद्रता के साथ ε बदलते हैं।
• प्रकीर्णन। धुंधले नमूने, कोशिकाएँ और अवक्षेप प्रकाश को डिटेक्टर से दूर बिखेर देते हैं, जो ऐसी अवशोषकता के रूप में पढ़ा जाता है जो है ही नहीं; जीवाणु कल्चर का OD600 जान-बूझकर यही नापता है।
• प्रतिदीप्ति। जो नमूना कुछ प्रकाश फिर से उत्सर्जित करता है, वह उसे डिटेक्टर तक भेजकर कम पाठ दे सकता है।
• प्रोटीन अलग-अलग होते हैं। 0.667 का आँकड़ा ऐल्ब्यूमिन का है; दूसरे प्रोटीनों में ट्रिप्टोफ़ैन और टायरोसीन की मात्रा अलग होती है और वे प्रति mg/mL आधा या दोगुना सोख सकते हैं।

कैलकुलेटर

बीयर-लैम्बर्ट नियम कैलकुलेटर से A = εlc को किसी भी पद के लिए हल करें, स्टैंडर्ड कर्व कैलकुलेटर से अपने पाठ फ़िट करें, और DNA सांद्रता कैलकुलेटर और प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर (A280) से न्यूक्लिक अम्ल और प्रोटीन की सांद्रता निकालें। गाइड स्टैंडर्ड कर्व कैसे बनाएँ और A280 पर प्रोटीन सांद्रता कैसे मापें आगे बताते हैं।