दो प्रावस्थाएँ
हर तरह की क्रोमैटोग्राफी में एक स्थिर प्रावस्था होती है जो अपनी जगह रहती है (कागज़ का सेलुलोज़, पतली परत की प्लेट का सिलिका जेल, कॉलम का भराव) और एक गतिशील प्रावस्था जो उसके पास से बहती है (एक विलायक, या गैस क्रोमैटोग्राफी में गैस)। मिश्रण का हर यौगिक लगातार दोनों के बीच आता-जाता है: गतिशील प्रावस्था में घुला हो तो आगे बढ़ता है, स्थिर प्रावस्था से चिपका हो तो रुकता है। जो यौगिक ज़्यादा समय चिपका रहता है वह धीरे चलता है, इसलिए अलग-अलग ताकत से चिपकने वाले यौगिक अलग हो जाते हैं।
चिपके रहने के समय और चलने के समय का अनुपात अवधारण गुणांक k है। k = 1 वाला यौगिक आधा समय चलता है और विलायक की आधी गति से आगे बढ़ता है।
ध्रुवता
सिलिका और सेलुलोज़ ध्रुवीय हैं, हाइड्रोजन बंध बनाने वाले OH समूहों से ढके। ध्रुवीय यौगिक (शर्कराएँ, अमीनो अम्ल, क्लोरोफ़िल b) उनसे चिपकते हैं; अध्रुवीय (कैरोटीन, वसा) मुश्किल से। विलायक उन्हीं जगहों के लिए होड़ करता है: ज़्यादा ध्रुवीय विलायक ध्रुवीय यौगिकों को हटाकर आगे ले जाता है। इसलिए सिलिका प्लेट पर हेक्सेन सिर्फ़ अध्रुवीय यौगिकों को चलाता है, एथिल ऐसीटेट मध्यम ध्रुवीय यौगिकों को, और एथेनॉल या पानी लगभग हर घुलने वाली चीज़ को। रिवर्स्ड-फ़ेज़ कॉलम, जिन पर लंबी हाइड्रोकार्बन शृंखलाएँ चढ़ी होती हैं, इसे उलट देते हैं: वहाँ अध्रुवीय यौगिक चिपकते हैं।
Rf मान
कागज़ या पतली परत की प्लेट पर विलायक नीचे से ऊपर रेंगता है, और उसके ऊपर पहुँचने से पहले दौड़ रोक दी जाती है। हर धब्बा विलायक की दूरी का एक तय हिस्सा तय कर चुका होता है:
Rf = धब्बे की तय दूरी ÷ विलायक अग्र की तय दूरी = 1 ÷ (1 + k)
दोनों दूरियाँ उस आधार रेखा से नापी जाती हैं जहाँ नमूना लगाया गया था। Rf 0 और 1 के बीच होता है, और किसी दी गई प्लेट, विलायक और तापमान पर हर यौगिक का Rf हर बार लगभग एक जैसा होता है, इसलिए किसी अज्ञात धब्बे को बगल में चलाए गए मानक से मिलाया जा सकता है।
एक हल किया उदाहरण
पालक का अर्क सिलिका प्लेट पर हेक्सेन और ऐसीटोन, 9 और 1 के अनुपात में, चलाया जाता है। अग्र आधार रेखा से 6.0 cm ऊपर रुकता है।
- 5.7 cm पर नारंगी धब्बा: Rf = 5.7 ÷ 6.0 = 0.95, β-कैरोटीन, सबसे कम ध्रुवीय वर्णक।
- 2.7 cm पर नीला-हरा धब्बा: Rf = 0.45, क्लोरोफ़िल a; k = 1 ÷ 0.45 − 1 = 1.2।
- 2.1 cm पर पीला-हरा धब्बा: Rf = 0.35, क्लोरोफ़िल b, जिसमें एक अतिरिक्त C=O समूह है और जो ज़्यादा ध्रुवीय है।
- 1.5 cm पर पीला धब्बा: Rf = 0.25, ज़ैंथोफ़िल, जिनके OH समूह सिलिका को पकड़ते हैं।
क्रम ध्रुवता के अनुसार है, सबसे कम ध्रुवीय सबसे ऊपर। इन वर्णकों के प्रकाशित मान प्लेट, विलायक मिश्रण और प्लेट कितनी सूखी है, इसके अनुसार प्रयोगशाला दर प्रयोगशाला बदलते हैं, इसीलिए मानक साथ में चलाए जाते हैं।
कॉलम और क्रोमैटोग्राम
कॉलम क्रोमैटोग्राफी (और HPLC और गैस क्रोमैटोग्राफी) में गतिशील प्रावस्था भरी हुई नली से बहती है और यौगिक सिरे पर एक के बाद एक निकलते हैं, एक डिटेक्टर में जो हर एक के लिए एक शिखर बनाता है। विलायक को ख़ुद पार होने में मृत समय t₀ लगता है; अवधारण गुणांक k वाले यौगिक को लगता है
tR = t₀ (1 + k)
चलते-चलते शिखर फैलते हैं, क्योंकि अणु भराव में अलग-अलग रास्ते लेते हैं और विसरित होते हैं। कॉलम की दक्षता उसकी सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या N है: शिखर की चौड़ाई (मानक विचलन) σ = tR ÷ √N है। एक अच्छे HPLC कॉलम में 10,000 या ज़्यादा प्लेटें होती हैं; हाथ से भरे गुरुत्व कॉलम में शायद कुछ सौ।
उदाहरण को t₀ = 2.7 मिनट और N = 2,000 वाले कॉलम पर आगे बढ़ाएँ: क्लोरोफ़िल a (k = 1.22) 2.7 × 2.22 = 6.0 मिनट पर σ = 6.0 ÷ √2000 = 0.13 मिनट के साथ निकलता है; क्लोरोफ़िल b (k = 1.86) 7.7 मिनट पर σ = 0.17 मिनट के साथ।
विभेदन
दो पड़ोसी अलग हैं या नहीं, यह उनके बीच के अंतर और उनकी चौड़ाइयों दोनों पर निर्भर है:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), जहाँ आधार चौड़ाई w = 4σ
दोनों क्लोरोफ़िल के लिए Rs = 2 × 1.72 ÷ (0.54 + 0.69) = 2.8: साफ़ अलग। Rs = 1.5 आधार रेखा तक पृथक्करण देता है; 1 पर शिखर लगभग 2% एक-दूसरे पर चढ़ते हैं; उससे नीचे वे मिल जाते हैं। पर्नेल समीकरण इसे सुधारने के तीन तरीके दिखाता है:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
जहाँ α = k₂ ÷ k₁। बेहतर कॉलम (बड़ा N) सिर्फ़ वर्गमूल जितना मदद करता है; α बदलने के लिए विलायक बदलना, यानी दोनों यौगिक कितने अलग ढंग से चिपकते हैं, आमतौर पर कहीं ज़्यादा मदद करता है।
सिम्युलेशन का उपयोग
क्रोमैटोग्राफी सिम्युलेटर में आज़माने के लिए:
- पत्ती के वर्णक हेक्सेन और ऐसीटोन में, फिर शुद्ध हेक्सेन में: हेक्सेन में सिर्फ़ कैरोटीन चलता है; क्लोरोफ़िल आधार रेखा के पास रहते हैं।
- काली स्याही पानी में: रंजक अलग होते हैं; हेक्सेन में वे बिल्कुल नहीं हिलते, क्योंकि घुलते नहीं।
- अमीनो अम्ल ब्यूटेनॉल, ऐसीटिक अम्ल और पानी में: जब तक आप निनहाइड्रिन से रंगें नहीं चुनते, कुछ नहीं दिखता, फिर ल्यूसीन और फ़ेनिलऐलानीन लगभग एक-दूसरे पर चढ़ जाते हैं।
- धब्बा 6 mm चौड़ा करें: हर धब्बा बढ़ता है और पड़ोसी मिल जाते हैं।
- कॉलम पर N को 2,000 से 200 करें और शिखरों को फैलते और विभेदन को गिरते देखें।
मॉडल क्या मानकर चलता है
- ध्रुवता का एक ही पैमाना। हर यौगिक की एक ध्रुवता संख्या है, जो ऐसे चुनी गई है कि एक संदर्भ विलायक में उसका Rf प्रकाशित मान से मिले, और हर विलायक की 0 से 1 के पैमाने पर एक संख्या है; k = e8(p − s)। असली अवधारण हाइड्रोजन बंध, अम्लता, आकार और आकृति पर निर्भर है, किसी एक संख्या पर नहीं।
- स्विच जैसी घुलनशीलता। स्याही के रंजक सिर्फ़ ध्रुवीय विलायकों में घुलते हैं, पत्ती के वर्णक पानी को छोड़ हर चीज़ में, अमीनो अम्ल सिर्फ़ काफ़ी ध्रुवीय विलायकों में; वरना Rf = 0।
- एक ही स्थिर प्रावस्था कागज़, पतली परत और कॉलम के लिए।
- समय के वर्गमूल की तरह चढ़ता अग्र (लुकास–वॉशबर्न नियम), विलायक पर निर्भर गति से।
- गाउसीय धब्बे और शिखर, जो विसरण से दूरी के साथ चौड़े होते हैं; छोटी मात्राएँ, इसलिए ओवरलोडिंग नहीं।
- 25 cm का कॉलम, 4.6 mm चौड़ा, 65% खाली जगह, इसलिए t₀ = 2.7 mL ÷ प्रवाह दर।
सीमांत स्थितियाँ
- Rf 0 या 1 के पास: यौगिक आधार रेखा या अग्र पर जमा हो जाते हैं और पहचाने नहीं जा सकते। विलायक चुनकर लगभग 0.2 और 0.8 के बीच Rf का लक्ष्य रखें।
- विलायक आधार रेखा से ऊपर: धब्बे चलने के बजाय नीचे विलायक में धुल जाते हैं।
- रंगहीन यौगिकों को दिखने के लिए ही रंजक चाहिए (अमीनो अम्लों के लिए निनहाइड्रिन, आयोडीन वाष्प, प्रतिदीप्त प्लेट पर UV प्रकाश)।
- एक जैसा Rf यह साबित नहीं करता कि दो यौगिक एक ही हैं; उन्हें दूसरे विलायक में चलाएँ, या अगल-बगल और मिलाकर (को-स्पॉटिंग)।
मॉडल कहाँ सही नहीं रहता
- टेलिंग और ओवरलोडिंग। बहुत ज़्यादा नमूना, या सिलिका पर अम्लीय और क्षारीय यौगिक, साफ़ गोलों के बजाय लकीरें और धूमकेतु जैसे धब्बे बनाते हैं।
- मिश्रित विलायक ख़ुद अलग होते हैं। मिश्रण का ज़्यादा ध्रुवीय हिस्सा प्लेट रोक लेती है, इसलिए प्लेट पर ऊपर जाते हुए विलायक की संरचना बदलती है, और सूखा, असंतृप्त टैंक चढ़ते विलायक को प्लेट से भाप बनने देता है; दोनों Rf मान खिसका देते हैं।
- तापमान और नमी Rf बदलते हैं, और हवा से पानी सोख चुकी सिलिका कम सक्रिय हो जाती है।
- ग्रेडिएंट इल्यूशन, जिसमें कॉलम दौड़ के दौरान विलायक धीरे-धीरे ज़्यादा प्रबल किया जाता है, ज़्यादातर HPLC का तरीका है; यह मॉडल विलायक को स्थिर रखता है।
- दूसरी क्रियाविधियाँ। आयन-विनिमय, आकार-अपवर्जन और बंधुता क्रोमैटोग्राफी आवेश, आकार और विशिष्ट बंधन से अलग करती हैं, ध्रुवता से नहीं।
संबंधित टूल
जेल वैद्युतकणसंचलन सिम्युलेटर DNA को आकार से अलग करता है, मिश्रण को अलग करने का एक और तरीका; स्पेक्ट्रोफ़ोटोमीटर और बियर-लैम्बर्ट नियम सिम्युलेटर दिखाता है कि डिटेक्टर कैसे नापता है कि किसी यौगिक की कितनी मात्रा निकलती है; और 3D अणु व्यूअर वे ध्रुवीय समूह दिखाता है जिनसे अणु चिपकते हैं।