クロマトグラフィーのしくみ: ペーパーと薄層の Rf 値、カラムの保持時間と分離度

2 つの相

どのクロマトグラフィーにも、その場にとどまる固定相 (ろ紙のセルロース、薄層プレートのシリカゲル、カラムの充填剤) と、その上を流れる移動相 (溶媒、またはガスクロマトグラフィーの気体) があります。混合物の各化合物は、絶えず 2 つの相の間を行き来しています。移動相に溶けている間は進み、固定相にくっついている間は待ちます。くっついている時間が長い化合物ほどゆっくり進むので、くっつく強さの違う化合物どうしが分かれます。

くっついている時間と動いている時間の比が保持係数 k です。k = 1 の化合物は時間の半分だけ動くので、溶媒の半分の速さで進みます。

極性

シリカやセルロースは極性があり、水素結合をつくる OH 基で覆われています。極性の化合物 (糖、アミノ酸、クロロフィル b) はそこにくっつき、無極性の化合物 (カロテン、脂肪) はほとんどくっつきません。溶媒も同じ場所を奪い合うので、極性の高い溶媒ほど極性の化合物を押しのけて遠くまで運びます。そのためシリカのプレートでは、ヘキサンは無極性の化合物だけを、酢酸エチルは中程度の極性の化合物を、エタノールや水は溶けるものほぼすべてを動かします。長い炭化水素鎖で覆った逆相カラムではこれが逆になり、無極性の化合物がくっつきます。

Rf 値

ろ紙や薄層プレートでは溶媒が下からしみ上がり、上端に届く前に展開を止めます。各スポットは溶媒の移動距離の一定の割合だけ進んでいます。

R_f = スポットの移動距離 ÷ 溶媒の先端の移動距離 = 1 ÷ (1 + k)

どちらの距離も試料を付けた原線から測ります。R_f は 0 から 1 の間の値で、プレート、溶媒、温度が同じなら各化合物はいつもほぼ同じ R_f を示すので、未知のスポットを隣で展開した標準と比べられます。

計算例

ホウレンソウの抽出液を、シリカのプレートでヘキサンとアセトン 9:1 を使って展開します。先端は原線から 6.0 cm の所で止まりました。

5.7 cm のオレンジのスポット: R_f = 5.7 ÷ 6.0 = 0.95、最も極性の低い色素の β-カロテンです。
2.7 cm の青緑のスポット: R_f = 0.45、クロロフィル a。k = 1 ÷ 0.45 − 1 = 1.2。
2.1 cm の黄緑のスポット: R_f = 0.35、クロロフィル b。C=O 基が 1 つ多く、極性が高い色素です。
1.5 cm の黄色のスポット: R_f = 0.25、キサントフィル類。OH 基でシリカをつかみます。

並び順は極性の順で、最も極性の低いものが一番上です。これらの色素について報告されている値は、プレート、溶媒の混合比、プレートの乾き具合によって研究室ごとに違うので、標準を隣で展開します。

カラムとクロマトグラム

カラムクロマトグラフィー (HPLC やガスクロマトグラフィーも同様) では、移動相が充填した管を流れ、化合物が出口から次々と出てきて検出器に入り、それぞれのピークが描かれます。溶媒そのものが通り抜けるのにかかる時間がデッドタイム t₀ で、保持係数 k の化合物にかかる時間は

t_R = t₀ (1 + k)

分子が充填剤の中を違う経路で進み、拡散もするので、ピークは進むうちに広がります。カラムの効率は理論段数 N で表し、ピークの幅 (標準偏差) は σ = t_R ÷ √N です。よい HPLC カラムは 10,000 段以上、手で詰めた重力式のカラムはおそらく数百段です。

例の続きとして t₀ = 2.7 分、N = 2,000 のカラムを考えると、クロロフィル a (k = 1.22) は 2.7 × 2.22 = 6.0 分に σ = 6.0 ÷ √2000 = 0.13 分で、クロロフィル b (k = 1.86) は 7.7 分に σ = 0.17 分で出てきます。

分離度

隣り合う 2 つが分かれているかどうかは、間隔と幅の両方で決まります。

R_s = 2 (t_R2 − t_R1) ÷ (w₁ + w₂)、ただしベースラインでの幅 w = 4σ

2 つのクロロフィルでは R_s = 2 × 1.72 ÷ (0.54 + 0.69) = 2.8 で、きれいに分かれています。R_s = 1.5 でベースラインまで分離し、1 ではピークが約 2% 重なり、それ以下では融合します。パーネルの式は、分離度を上げる 3 つの方法を示しています。

R_s = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))

ここで α = k₂ ÷ k₁ です。よいカラム (大きな N) は平方根でしか効きません。溶媒を変えて α、つまり 2 つの化合物のくっつき方の違いを変えるほうが、ふつうはずっと効果的です。

シミュレーションの使い方

クロマトグラフィーシミュレーターで試してみること:

葉の色素をヘキサンとアセトンで、次に純粋なヘキサンで展開する: ヘキサンではカロテンだけが動き、クロロフィルは原線の近くにとどまります。
黒インクを水で展開する: 染料が分かれます。ヘキサンでは溶けないので、まったく動きません。
アミノ酸をブタノール・酢酸・水で展開する: ニンヒドリンで発色させるにチェックを入れるまで何も見えず、入れるとロイシンとフェニルアラニンがほとんど重なっています。
スポットの直径を 6 mm にする: どのスポットも大きくなり、隣どうしが融合します。
カラムで N を 2,000 から 200 に下げる: ピークが広がり、分離度が下がります。

モデルの前提

1 つの極性の尺度。各化合物には、1 つの基準溶媒での R_f が報告値と一致するよう選んだ極性の値が 1 つあり、各溶媒にも 0 から 1 の尺度で 1 つの値があります。k = e^{8(p − s)} です。実際の保持は水素結合、酸性度、大きさ、形で決まり、1 つの数では表せません。
溶けるか溶けないかの二択。インクの染料は極性溶媒にだけ、葉の色素は水以外なら何にでも、アミノ酸はかなり極性の高い溶媒にだけ溶け、それ以外では R_f = 0 です。
同じ固定相をろ紙、薄層、カラムに使っています。
時間の平方根に比例して上がる先端 (ルーカス・ウォッシュバーンの法則) で、速さは溶媒によって変わります。
ガウス型のスポットとピークで、拡散によって距離とともに広がります。試料は少量で、過負荷はありません。
長さ 25 cm のカラムで、内径 4.6 mm、空隙率 65% なので、t₀ = 2.7 mL ÷ 流量です。

境界的なケース

R_f が 0 や 1 に近い: 化合物が原線や先端に固まり、区別できません。溶媒を選んで R_f がおよそ 0.2 〜 0.8 になるようにします。
溶媒が原線より上: スポットは上がっていかずに、底の溶媒へ溶け出します。
無色の化合物は、発色剤 (アミノ酸にはニンヒドリン、ヨウ素蒸気、蛍光プレートへの紫外線) がないとそもそも見えません。
R_f が同じでも、2 つの化合物が同じだという証明にはなりません。別の溶媒で展開するか、並べて、また混ぜて (コスポット) 展開します。

モデルが成り立たなくなる場合

テーリングと過負荷。試料が多すぎたり、酸性や塩基性の化合物をシリカで展開したりすると、きれいな円ではなく、尾を引いた彗星のようなスポットになります。
混合溶媒は自分自身も分離する。混合物のうち極性の高い成分がプレートに引き止められるので、上へ行くほど溶媒の組成が変わります。展開槽が乾いて飽和していないと、上がる途中で溶媒がプレートから蒸発します。どちらも R_f をずらします。
温度と湿度で R_f は変わり、空気中の水分を吸ったシリカは活性が下がります。
グラジエント溶離、つまりカラムの展開中に溶媒をだんだん強くする方法が HPLC ではふつうですが、このモデルは溶媒を一定にしています。
ほかのしくみ。イオン交換、サイズ排除、アフィニティークロマトグラフィーは、極性ではなく電荷、大きさ、特異的な結合で分けます。

クロマトグラフィーのしくみ: Rf 値、カラム、分離度