ランベルト・ベールの法則の解説: 吸光度、透過率、吸収スペクトルと検量線

分光光度計のしくみ

ランプが白色光を出します (可視光にはタングステンランプ、紫外線には重水素ランプ)。モノクロメーター、つまりスリット付きのプリズムや回折格子が、狭い波長帯を選び出します。その光がセルに入れた試料を通り、検出器に当たります。まず溶媒だけを入れたセル、つまりブランクを測って I₀ を得て、次に試料を測って I を得ます。一方を他方で割ると、ランプの明るさ、セルの反射、溶媒自身の吸収が打ち消されます。

透過率と吸光度

T = I ÷ I₀、A = −log₁₀ T

透過率は通り抜けた光の割合です。吸光度はその対数にマイナスを付けたもので、試料の中で 1 mm ごとに同じ割合ずつ光が弱まるようすを、吸収する物質の量に比例して直線的に増える数に変えます。

A = 0: 光がすべて通ります。
A = 1: 10% が通ります。
A = 2: 1%。A = 3: 0.1%。

ランベルト・ベールの法則

A = ε l c

ε はその波長での物質の吸光係数で、どれだけ強く吸収するかを表します。M⁻¹ cm⁻¹ で表したものがモル吸光係数です。
l は試料の中の光路長で、標準のセルでは 1 cm です。
c は濃度です。

濃度か光路長を 2 倍にすると吸光度も 2 倍になります。ε がわかっていれば、この法則で測った吸光度をそのまま濃度に換算できます。

計算例

過マンガン酸カリウムは 525 nm で ε = 2,455 M⁻¹ cm⁻¹ です。80 µM の溶液を 1 cm のセルで測ると A = 2,455 × 1 × 0.000080 = 0.196、T = 10^−0.196 = 63.7% です。
タンパク質: ウシ血清アルブミンはトリプトファンとチロシンのおかげで、280 nm で 1 mg/mL・1 cm あたり 0.667 吸収します。読みが 0.40 なら 0.40 ÷ 0.667 = 0.60 mg/mL です。
DNA: 二本鎖 DNA は 50 µg/mL で A₂₆₀ = 1.0 になります。10 倍に希釈して 0.25 と読めた試料は 0.25 × 50 × 10 = 125 µg/mL です。純粋な DNA の A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ は約 1.8 で、これより低ければタンパク質の混入が疑われます。

吸収スペクトル

吸光度を波長に対してプロットすると、その物質の吸収スペクトルになります。測定はピーク λ_max で行います。そこでは読みが最大なので最も感度が高く、しかも曲線が平らなので波長の小さな誤差の影響が最も小さくなります。溶液は吸収しない光の色に見えます。過マンガン酸は緑 (525 nm 付近) を吸収して紫に見え、硫酸銅は赤と近赤外 (800 nm 付近) を吸収して淡い青に見えます。

検量線

その試料と条件での ε がわからないことや、装置を確認する必要があることはよくあります。そのときは濃度既知の標準液を何本か測り、吸光度を濃度に対してプロットして直線 A = m c + b を当てはめます。未知試料の濃度は c = (A − b) ÷ m です。

例: 0、25、50、100 µM の過マンガン酸標準液の読みが 0.000、0.061、0.123、0.245 だったとします。当てはめた傾きは 1 µM あたり 0.00245 で、切片はほぼ 0 です。読みが 0.150 の未知試料は 0.150 ÷ 0.00245 = 61 µM です。結果を信頼できるのは標準液の範囲内で、R² が 1 に近いときだけです。

シミュレーションの使い方

分光光度計とランベルト・ベールの法則のシミュレーターで試してみること:

過マンガン酸をピークで測る: 濃度を 2 倍にすると吸光度は 2 倍になり、透過率は 64% から 41% に下がります。
光路長を半分にする: 吸光度は半分になります。
濃度を最大まで上げる: 測定した吸光度はランベルト・ベールの直線より下に外れ、迷光のため 3 付近で頭打ちになります。0.1% の迷光を含めるのチェックを外すと、両者は一致します。
過マンガン酸の細いピークでスリットを 20 nm に広げる: ピークの吸光度が下がり、スペクトルがなめらかになります。
DNA を 260 nm、プラスチックセルで測る: セルが紫外線をほとんど吸収してしまい、読みはノイズだけになります。
標準液を 4 本加えて未知試料を測り、結果を表示される本当の値と比べる。

モデルの前提

なめらかなピークで組み立てた吸収スペクトルを、1 つの波長での報告値に合わせて拡大縮小しています。過マンガン酸は 525 nm で 2,455 M⁻¹ cm⁻¹、硫酸銅は 810 nm で約 12.5 M⁻¹ cm⁻¹、アルブミンは 280 nm で 1 mg/mL あたり 0.667、DNA は 260 nm で 1 µg/mL あたり 0.020 です。それ以外の波長での形は近似です。
三角形のスリット帯域: 読みはスリット幅の ± の範囲で透過率を平均したものです。
0.1% の迷光が、選んだ波長で吸収物質を通らずに検出器へ届きます。
セル: 石英は 200 nm 以上のすべての波長で光を通し、ポリスチレンは約 300 nm 以下で光を通さなくなります。
わずかな検出器ノイズがあり、読みは最後の桁で揺れ、ほとんど光が通らないときは信頼できなくなります。
ブランクがセルと溶媒を正確に打ち消し、未知試料はリセットのたびに溶液ごとに新しいランダムな濃度になります。

境界的なケース

濃度 0 では、ブランクと同じセル・同じ溶媒なので、ノイズを除けば A = 0 になります。
何も吸収しない波長では、どの濃度でも A ≈ 0 です。硫酸銅は緑の光をほとんど吸収しません。
非常に高い吸光度は、迷光の −log₁₀ 付近、0.1% なら約 3 で上限に達します。
標準液をある波長で、未知試料を別の波長で測ると、意味のない結果になります。シミュレーションが警告します。

モデルが成り立たなくなる場合

濃い溶液。約 10 mM を超えると分子どうしが近くなって互いの吸収に影響し、屈折率も変わります。装置が完璧でも直線は曲がります。
セルの中の化学。対をつくる色素、pH で色が変わる酸や塩基、希釈で解離する錯体は、どれも濃度によって ε が変わります。
散乱。濁った試料、細胞、沈殿は光を検出器の外へ散らすので、実際にはない吸光度として読まれます。細菌培養の OD600 は、まさにこれを意図して測っています。
蛍光。光の一部を再び放出する試料は、それを検出器へ送って低い値を示すことがあります。
タンパク質ごとの違い。0.667 はアルブミンの値です。ほかのタンパク質はトリプトファンとチロシンの量が違い、1 mg/mL あたりの吸収が半分や 2 倍になることもあります。

計算ツール

ランベルト・ベールの法則では A = εlc をどの項についても解けます。ご自分の測定値は検量線の計算で当てはめ、核酸とタンパク質の濃度はDNA 濃度の計算とタンパク質濃度の計算（A280）で求められます。ガイドの検量線の作り方とA280でタンパク質濃度を測る方法でさらに詳しく説明しています。

ランベルト・ベールの法則の解説: 吸光度、分光光度計、検量線