Cómo funciona un espectrofotómetro
Una lámpara da luz blanca (una lámpara de wolframio para el visible, una de deuterio para el ultravioleta). Un monocromador, un prisma o una red de difracción con una rendija, selecciona una banda estrecha de longitudes de onda. Esa luz atraviesa la muestra en una cubeta y llega a un detector. Primero se mide un blanco, la cubeta solo con el disolvente, que da I₀; luego la muestra da I. Al dividir una por otra se cancelan el brillo de la lámpara, los reflejos de la cubeta y la absorción propia del disolvente.
Transmitancia y absorbancia
T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T
La transmitancia es la fracción de luz que pasa. La absorbancia es su logaritmo negativo, que convierte la forma en que la luz se apaga en una muestra, la misma fracción en cada milímetro, en un número que crece en línea recta con la cantidad de sustancia que absorbe:
- A = 0: pasa toda la luz.
- A = 1: pasa el 10 %.
- A = 2: el 1 %. A = 3: el 0,1 %.
La ley de Beer-Lambert
A = ε l c
- ε es la absortividad de la sustancia a esa longitud de onda: lo fuerte que absorbe. En M⁻¹ cm⁻¹ es la absortividad molar, o coeficiente de extinción.
- l es el camino óptico a través de la muestra, 1 cm en una cubeta estándar.
- c es la concentración.
Si duplicas la concentración o el camino, la absorbancia se duplica. La ley permite convertir directamente una absorbancia medida en una concentración cuando se conoce ε.
Ejemplos resueltos
- El permanganato de potasio tiene ε = 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ a 525 nm. Una disolución 80 µM en una cubeta de 1 cm: A = 2.455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10−0,196 = 63,7 %.
- Proteína: la albúmina de suero bovino absorbe 0,667 por mg/mL y por cm a 280 nm, por su triptófano y su tirosina. Una lectura de 0,40 significa 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL.
- ADN: el ADN de doble cadena a 50 µg/mL da A260 = 1,0. Una muestra diluida 1 en 10 que lee 0,25 contiene 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. El ADN puro tiene una relación A260 ÷ A280 de alrededor de 1,8; una relación menor sugiere que contiene proteína.
Espectros de absorción
Representar la absorbancia frente a la longitud de onda da el espectro de absorción de la sustancia. Mide en su máximo, λmax: la lectura es la mayor, y por tanto la más sensible, y la curva es plana allí, así que los pequeños errores de longitud de onda importan menos. Una disolución tiene el color de la luz que no absorbe: el permanganato absorbe el verde (hacia 525 nm) y se ve morado; el sulfato de cobre absorbe el rojo y el infrarrojo cercano (hacia 800 nm) y se ve azul pálido.
Curvas de calibrado
A menudo no se conoce ε para la muestra y las condiciones exactas, o hay que comprobar el aparato. Entonces se mide una serie de patrones de concentración conocida, se representa la absorbancia frente a la concentración y se ajusta una recta A = m c + b. La concentración de una desconocida es c = (A − b) ÷ m.
Ejemplo: patrones de permanganato de 0, 25, 50 y 100 µM leen 0,000, 0,061, 0,123 y 0,245. La pendiente ajustada es 0,00245 por µM con una ordenada en el origen cercana a cero. Una desconocida que lee 0,150 tiene 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM. Fíate del resultado solo dentro del intervalo de los patrones, y solo si R² está cerca de 1.
Cómo usar la simulación
En el Simulador de espectrofotómetro y ley de Beer-Lambert, cosas que probar:
- Permanganato en su máximo: duplica la concentración y la absorbancia se duplica, mientras la transmitancia baja del 64 % al 41 %.
- Reduce el camino óptico a la mitad: la absorbancia se reduce a la mitad.
- Sube la concentración al máximo: la absorbancia medida queda por debajo de la recta de Beer-Lambert y se aplana cerca de 3 por la luz parásita. Desmarca Incluir 0,1 % de luz parásita y las dos coinciden.
- Abre la rendija a 20 nm en los picos estrechos del permanganato: la absorbancia del pico baja y el espectro se suaviza.
- Elige ADN a 260 nm en una cubeta de plástico: la cubeta absorbe casi todo el ultravioleta y la lectura se vuelve ruido.
- Añade cuatro patrones, mide la desconocida y compara el resultado con el valor real que se muestra.
Qué supone el modelo
- Espectros de absorción construidos con picos suaves, escalados a valores publicados en una longitud de onda: permanganato 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ a 525 nm, sulfato de cobre unos 12,5 M⁻¹ cm⁻¹ a 810 nm, albúmina 0,667 por mg/mL a 280 nm, ADN 0,020 por µg/mL a 260 nm. Las formas en otras zonas son aproximadas.
- Una banda de rendija triangular: la lectura promedia la transmitancia en ± la anchura de rendija.
- Luz parásita del 0,1 % que llega al detector sin atravesar la sustancia a la longitud de onda elegida.
- Cubetas: el cuarzo transmite en todo el intervalo desde 200 nm; el poliestireno deja de transmitir por debajo de unos 300 nm.
- Un poco de ruido del detector, de modo que las lecturas bailan en la última cifra y dejan de ser fiables cuando casi no pasa luz.
- El blanco cancela exactamente la cubeta y el disolvente, y la desconocida tiene una concentración aleatoria nueva para cada disolución después de Reiniciar.
Casos límite
- Concentración cero da A = 0, salvo el ruido, porque el blanco es la misma cubeta con el mismo disolvente.
- Longitudes de onda donde nada absorbe dan A ≈ 0 a cualquier concentración; el sulfato de cobre apenas absorbe en el verde.
- Una absorbancia muy alta llega a un techo cerca de −log₁₀ de la luz parásita: alrededor de 3 para el 0,1 %.
- Patrones a una longitud de onda y la desconocida a otra dan un resultado sin sentido; la simulación avisa.
Dónde deja de valer el modelo
- Disoluciones concentradas. Por encima de unos 10 mM, las moléculas están tan juntas que afectan a la absorción de las demás, y el índice de refracción cambia; la recta se curva incluso con un aparato perfecto.
- Química en la cubeta. Los colorantes que se emparejan, los ácidos y bases cuyo color depende del pH y los complejos que se disocian al diluirse cambian todos ε con la concentración.
- Dispersión. Las muestras turbias, las células y los precipitados desvían la luz fuera del detector, lo que se lee como una absorbancia que no existe; es justo lo que mide a propósito la DO600 de un cultivo bacteriano.
- Fluorescencia. Una muestra que reemite parte de la luz puede enviarla al detector y dar una lectura baja.
- Las proteínas son distintas. La cifra de 0,667 es para la albúmina; otras proteínas tienen otras cantidades de triptófano y tirosina y pueden absorber la mitad o el doble por mg/mL.
Calculadoras
Despeja cualquier término de A = εlc con la Calculadora de la ley de Beer-Lambert, ajusta tus propias lecturas con la Calculadora de curva estándar y calcula concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas con la Calculadora de concentración de ADN y la Calculadora de concentración de proteínas (A280). Las guías Cómo hacer una curva estándar y Cómo medir la concentración de proteínas a A280 van más allá.