Dos fases
Toda cromatografía tiene una fase estacionaria que se queda quieta (la celulosa del papel, el gel de sílice de una placa de capa fina, el relleno de una columna) y una fase móvil que pasa por ella (un disolvente, o un gas en la cromatografía de gases). Cada compuesto de la mezcla va y viene sin parar entre las dos: disuelto en la fase móvil avanza, pegado a la fase estacionaria espera. Un compuesto que pasa más tiempo pegado avanza más despacio, así que los compuestos que se pegan con distinta fuerza se separan.
La relación entre el tiempo pegado y el tiempo en movimiento es el factor de retención k. Un compuesto con k = 1 pasa la mitad del tiempo moviéndose y avanza a la mitad de la velocidad del disolvente.
Polaridad
La sílice y la celulosa son polares, cubiertas de grupos OH que forman puentes de hidrógeno. Los compuestos polares (azúcares, aminoácidos, clorofila b) se adhieren a ellas; los apolares (caroteno, grasas) apenas. El disolvente compite por los mismos sitios: uno más polar desplaza a los compuestos polares y los lleva más lejos. Así, en una placa de sílice el hexano solo mueve compuestos apolares, el acetato de etilo mueve los moderadamente polares y el etanol o el agua mueven casi todo lo que se disuelve. Las columnas de fase inversa, recubiertas de largas cadenas de hidrocarburo, le dan la vuelta: en ellas se pegan los compuestos apolares.
Valores Rf
En el papel o en una placa de capa fina, el disolvente sube desde abajo y la carrera se detiene antes de que llegue arriba. Cada mancha ha recorrido una fracción fija de la distancia del disolvente:
Rf = distancia recorrida por la mancha ÷ distancia recorrida por el frente del disolvente = 1 ÷ (1 + k)
Las dos distancias se miden desde la línea de base donde se puso la muestra. Rf está entre 0 y 1, y para una placa, un disolvente y una temperatura dados cada compuesto tiene más o menos el mismo Rf cada vez, así que una mancha desconocida puede compararse con un patrón corrido a su lado.
Un ejemplo resuelto
Un extracto de espinaca se corre en una placa de sílice con hexano y acetona, 9 a 1. El frente se detiene a 6,0 cm de la línea de base.
- Una mancha naranja a 5,7 cm: Rf = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, β-caroteno, el pigmento menos polar.
- Una mancha verde azulada a 2,7 cm: Rf = 0,45, clorofila a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
- Una mancha verde amarillenta a 2,1 cm: Rf = 0,35, clorofila b, que tiene un grupo C=O más y es más polar.
- Una mancha amarilla a 1,5 cm: Rf = 0,25, las xantofilas, con grupos OH que se agarran a la sílice.
El orden sigue la polaridad, con el menos polar arriba. Los valores publicados para estos pigmentos varían de un laboratorio a otro con la placa, la mezcla de disolventes y lo seca que esté la placa, y por eso se corren patrones al lado.
Columnas y cromatogramas
En la cromatografía en columna (y en la HPLC y la cromatografía de gases), la fase móvil fluye por un tubo relleno y los compuestos salen por el extremo uno tras otro hacia un detector que dibuja un pico para cada uno. El propio disolvente tarda el tiempo muerto t₀ en atravesarla; un compuesto con factor de retención k tarda
tR = t₀ (1 + k)
Los picos se ensanchan durante el recorrido, porque las moléculas siguen caminos distintos por el relleno y se difunden. La eficiencia de una columna es su número de platos teóricos N: la anchura del pico (desviación estándar) es σ = tR ÷ √N. Una buena columna de HPLC tiene 10.000 platos o más; una columna de gravedad rellenada a mano, quizá unos cientos.
Siguiendo con el ejemplo en una columna con t₀ = 2,7 min y N = 2.000: la clorofila a (k = 1,22) sale a 2,7 × 2,22 = 6,0 min con σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 min; la clorofila b (k = 1,86), a 7,7 min con σ = 0,17 min.
Resolución
Que dos vecinos estén separados depende tanto de la distancia entre ellos como de sus anchuras:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), con la anchura de base w = 4σ
Para las dos clorofilas, Rs = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: bien separadas. Rs = 1,5 da separación hasta la línea de base; con 1 los picos se solapan cerca de un 2 %; por debajo se funden. La ecuación de Purnell muestra las tres formas de mejorarla:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
con α = k₂ ÷ k₁. Una columna mejor (N mayor) solo ayuda con la raíz cuadrada; cambiar el disolvente para cambiar α, lo distinto que se pegan los dos compuestos, suele ayudar mucho más.
Cómo usar la simulación
En el Simulador de cromatografía, cosas que probar:
- Pigmentos de hoja en hexano y acetona, luego en hexano puro: en hexano solo se mueve el caroteno; las clorofilas se quedan cerca de la línea de base.
- Tinta negra en agua: los colorantes se separan; en hexano no se mueven nada, porque no se disuelven.
- Aminoácidos en butanol, ácido acético y agua: no se ve nada hasta que marcas Revelar con ninhidrina, y entonces la leucina y la fenilalanina casi se solapan.
- Haz la mancha de 6 mm: todas las manchas crecen y las vecinas se funden.
- En la columna, baja N de 2.000 a 200 y mira cómo los picos se ensanchan y la resolución cae.
Qué supone el modelo
- Una sola escala de polaridad. Cada compuesto tiene un número de polaridad, elegido para que su Rf coincida con un valor publicado en un disolvente de referencia, y cada disolvente tiene uno en una escala de 0 a 1; k = e8(p − s). La retención real depende de los puentes de hidrógeno, la acidez, el tamaño y la forma, no de un solo número.
- La solubilidad como interruptor. Los colorantes de la tinta solo se disuelven en disolventes polares, los pigmentos de hoja en cualquiera menos el agua, los aminoácidos solo en disolventes bastante polares; si no, Rf = 0.
- La misma fase estacionaria para el papel, la capa fina y la columna.
- Un frente que sube con la raíz cuadrada del tiempo (la ley de Lucas-Washburn), a una velocidad que depende del disolvente.
- Manchas y picos gaussianos, que se ensanchan con la distancia por difusión; cantidades pequeñas, así que sin sobrecarga.
- Una columna de 25 cm, de 4,6 mm de diámetro y un 65 % de espacio libre, así que t₀ = 2,7 mL ÷ el caudal.
Casos límite
- Rf cerca de 0 o de 1: los compuestos se amontonan en la línea de base o en el frente y no se pueden distinguir. Busca valores de Rf entre 0,2 y 0,8 más o menos eligiendo el disolvente.
- Disolvente por encima de la línea de base: las manchas se disuelven en el disolvente del fondo en vez de correr.
- Los compuestos incoloros necesitan un revelador (ninhidrina para aminoácidos, vapor de yodo, luz ultravioleta sobre una placa fluorescente) para verse siquiera.
- Un Rf idéntico no demuestra que dos compuestos sean el mismo; córrelos en un segundo disolvente, o uno al lado del otro y mezclados (co-siembra).
Dónde deja de valer el modelo
- Colas y sobrecarga. Demasiada muestra, o compuestos ácidos y básicos sobre sílice, producen estelas y manchas en forma de cometa en lugar de círculos limpios.
- Las mezclas de disolventes se separan solas. La parte más polar de una mezcla queda retenida por la placa, así que la composición del disolvente cambia a lo largo de la placa, y una cubeta seca y sin saturar deja que el disolvente se evapore de la placa mientras sube; ambas cosas desplazan los valores de Rf.
- La temperatura y la humedad cambian el Rf, y la sílice que ha tomado agua del aire se vuelve menos activa.
- La elución en gradiente, en la que el disolvente se hace poco a poco más fuerte durante una carrera en columna, es como se hace la mayor parte de la HPLC; este modelo mantiene fijo el disolvente.
- Otros mecanismos. La cromatografía de intercambio iónico, de exclusión por tamaño y de afinidad separa por carga, tamaño y unión específica, no por polaridad.
Herramientas relacionadas
El Simulador de electroforesis en gel separa el ADN por tamaño, otra forma de descomponer una mezcla; el Simulador de espectrofotómetro y ley de Beer-Lambert muestra cómo un detector mide cuánto sale de un compuesto; y el Visor de moléculas 3D muestra los grupos polares que hacen que las moléculas se peguen.