Dua fase
Setiap jenis kromatografi punya fase diam yang tetap di tempatnya (selulosa kertas, gel silika pelat KLT, isian kolom) dan fase gerak yang mengalir melewatinya (pelarut, atau gas dalam kromatografi gas). Setiap senyawa dalam campuran terus berpindah di antara keduanya: saat terlarut di fase gerak ia bergerak, saat menempel di fase diam ia menunggu. Senyawa yang lebih lama menempel bergerak lebih lambat, jadi senyawa yang menempel dengan kekuatan berbeda akan terpisah.
Perbandingan waktu menempel terhadap waktu bergerak adalah faktor retensi k. Senyawa dengan k = 1 menghabiskan separuh waktunya bergerak dan berjalan dengan setengah kecepatan pelarut.
Polaritas
Silika dan selulosa bersifat polar, dilapisi gugus OH yang membentuk ikatan hidrogen. Senyawa polar (gula, asam amino, klorofil b) melekat padanya; senyawa nonpolar (karoten, lemak) hampir tidak. Pelarut bersaing untuk tempat yang sama: pelarut yang lebih polar menggeser senyawa polar dan membawanya lebih jauh. Jadi di pelat silika, heksana hanya menggerakkan senyawa nonpolar, etil asetat menggerakkan senyawa yang cukup polar, dan etanol atau air menggerakkan hampir semua yang larut. Kolom fase terbalik, yang dilapisi rantai hidrokarbon panjang, membalik keadaan ini: di sana senyawa nonpolar yang menempel.
Nilai Rf
Di kertas atau pelat KLT, pelarut merambat naik dari bawah dan proses dihentikan sebelum mencapai puncak. Setiap noda telah menempuh bagian tetap dari jarak pelarut:
Rf = jarak tempuh noda ÷ jarak tempuh garis depan pelarut = 1 ÷ (1 + k)
Kedua jarak diukur dari garis awal tempat sampel ditotolkan. Rf bernilai antara 0 dan 1, dan untuk pelat, pelarut, dan suhu tertentu setiap senyawa punya Rf yang kurang lebih sama setiap kali, sehingga noda yang tidak diketahui bisa dicocokkan dengan standar yang dijalankan di sebelahnya.
Contoh perhitungan
Ekstrak bayam dijalankan pada pelat silika dalam heksana dan aseton, 9 banding 1. Garis depan berhenti 6,0 cm di atas garis awal.
- Noda jingga pada 5,7 cm: Rf = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, β-karoten, pigmen yang paling tidak polar.
- Noda hijau kebiruan pada 2,7 cm: Rf = 0,45, klorofil a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
- Noda hijau kekuningan pada 2,1 cm: Rf = 0,35, klorofil b, yang punya satu gugus C=O tambahan dan lebih polar.
- Noda kuning pada 1,5 cm: Rf = 0,25, xantofil, dengan gugus OH yang mencengkeram silika.
Urutannya mengikuti polaritas, yang paling tidak polar di atas. Nilai yang diterbitkan untuk pigmen ini berbeda dari satu laboratorium ke laboratorium lain menurut pelat, campuran pelarut, dan kekeringan pelat, itulah sebabnya standar dijalankan di sampingnya.
Kolom dan kromatogram
Dalam kromatografi kolom (juga HPLC dan kromatografi gas), fase gerak mengalir melalui tabung berisi isian dan senyawa-senyawa keluar di ujungnya satu per satu, ke detektor yang menggambar satu puncak untuk masing-masing. Pelarut itu sendiri butuh waktu mati t₀ untuk melintas; senyawa dengan faktor retensi k butuh
tR = t₀ (1 + k)
Puncak melebar selama perjalanan, karena molekul menempuh jalur berbeda melalui isian dan berdifusi. Efisiensi kolom adalah jumlah pelat teoretis N: lebar puncak (simpangan baku) adalah σ = tR ÷ √N. Kolom HPLC yang baik punya 10.000 pelat atau lebih; kolom gravitasi yang diisi dengan tangan mungkin beberapa ratus.
Melanjutkan contoh pada kolom dengan t₀ = 2,7 menit dan N = 2.000: klorofil a (k = 1,22) keluar pada 2,7 × 2,22 = 6,0 menit dengan σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 menit; klorofil b (k = 1,86) pada 7,7 menit dengan σ = 0,17 menit.
Resolusi
Apakah dua tetangga terpisah bergantung pada jarak di antara keduanya dan lebarnya:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), dengan lebar dasar w = 4σ
Untuk kedua klorofil, Rs = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: terpisah bersih. Rs = 1,5 memberi pemisahan sampai garis dasar; pada 1 puncaknya tumpang tindih sekitar 2%; di bawahnya keduanya menyatu. Persamaan Purnell menunjukkan tiga cara memperbaikinya:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
dengan α = k₂ ÷ k₁. Kolom yang lebih baik (N lebih besar) hanya membantu sebanding akar kuadratnya; mengganti pelarut untuk mengubah α, yaitu seberapa berbeda kedua senyawa menempel, biasanya jauh lebih membantu.
Memakai simulasi
Di Simulator Kromatografi, hal yang bisa dicoba:
- Pigmen daun dalam heksana dan aseton, lalu dalam heksana murni: dalam heksana hanya karoten yang bergerak; klorofil tetap dekat garis awal.
- Tinta hitam dalam air: zat warnanya terpisah; dalam heksana zat warnanya sama sekali tidak bergerak, karena tidak larut.
- Asam amino dalam butanol, asam asetat, dan air: tidak ada yang terlihat sampai kamu mencentang Warnai dengan ninhidrin, lalu leusin dan fenilalanin hampir tumpang tindih.
- Buat totolan selebar 6 mm: setiap noda membesar dan noda yang bersebelahan menyatu.
- Di kolom, turunkan N dari 2.000 menjadi 200 dan lihat puncaknya melebar dan resolusinya turun.
Asumsi model
- Satu skala polaritas. Setiap senyawa punya satu angka polaritas, dipilih agar Rf-nya cocok dengan nilai yang diterbitkan dalam satu pelarut acuan, dan setiap pelarut punya satu angka pada skala 0 sampai 1; k = e8(p − s). Retensi sungguhan bergantung pada ikatan hidrogen, keasaman, ukuran, dan bentuk, bukan pada satu angka.
- Kelarutan sebagai sakelar. Zat warna tinta hanya larut dalam pelarut polar, pigmen daun dalam apa saja kecuali air, asam amino hanya dalam pelarut yang cukup polar; selain itu Rf = 0.
- Fase diam yang sama untuk kertas, KLT, dan kolom.
- Garis depan yang naik sebanding akar kuadrat waktu (hukum Lucas-Washburn), dengan kecepatan yang bergantung pada pelarut.
- Noda dan puncak berbentuk Gauss, yang melebar seiring jarak karena difusi; jumlah sampel kecil, jadi tidak ada kelebihan muatan.
- Kolom 25 cm, berdiameter 4,6 mm dengan 65% ruang kosong, jadi t₀ = 2,7 mL ÷ laju alir.
Kasus batas
- Rf mendekati 0 atau 1: senyawa menumpuk di garis awal atau di garis depan dan tidak bisa dibedakan. Usahakan nilai Rf antara sekitar 0,2 dan 0,8 dengan memilih pelarut.
- Pelarut di atas garis awal: noda larut ke pelarut di dasar alih-alih merambat naik.
- Senyawa tidak berwarna membutuhkan pewarna (ninhidrin untuk asam amino, uap iodin, sinar UV pada pelat berfluoresensi) agar bisa terlihat sama sekali.
- Rf yang sama tidak membuktikan dua senyawa identik; jalankan keduanya dalam pelarut kedua, atau berdampingan dan dicampur (ko-totol).
Di mana model tidak lagi berlaku
- Pengekoran dan kelebihan muatan. Sampel terlalu banyak, atau senyawa asam dan basa pada silika, menghasilkan coretan dan noda berbentuk komet alih-alih lingkaran rapi.
- Campuran pelarut memisahkan dirinya sendiri. Bagian campuran yang lebih polar ditahan oleh pelat, jadi komposisi pelarut berubah di sepanjang pelat, dan bejana yang kering dan tidak jenuh membuat pelarut menguap dari pelat selama merambat; keduanya menggeser nilai Rf.
- Suhu dan kelembapan mengubah Rf, dan silika yang menyerap air dari udara menjadi kurang aktif.
- Elusi gradien, ketika pelarut dibuat makin kuat secara bertahap selama proses di kolom, adalah cara kebanyakan HPLC dijalankan; model ini menjaga pelarut tetap.
- Mekanisme lain. Kromatografi penukar ion, eksklusi ukuran, dan afinitas memisahkan menurut muatan, ukuran, dan ikatan spesifik, bukan polaritas.
Alat terkait
Simulator Elektroforesis Gel memisahkan DNA menurut ukuran, cara lain mengurai campuran; Simulator Spektrofotometer dan Hukum Beer-Lambert menunjukkan bagaimana detektor mengukur berapa banyak senyawa yang keluar; dan Penampil Molekul 3D menunjukkan gugus polar yang membuat molekul menempel.