Duas fases
Todo tipo de cromatografia tem uma fase estacionária que fica parada (a celulose do papel, a sílica gel de uma placa de camada delgada, o recheio de uma coluna) e uma fase móvel que passa por ela (um solvente, ou um gás na cromatografia gasosa). Cada composto da mistura vai e volta o tempo todo entre as duas: dissolvido na fase móvel, ele avança; grudado na fase estacionária, ele espera. Um composto que passa mais tempo grudado avança mais devagar, então compostos que grudam com forças diferentes se separam.
A razão entre o tempo grudado e o tempo em movimento é o fator de retenção k. Um composto com k = 1 passa metade do tempo se movendo e avança à metade da velocidade do solvente.
Polaridade
A sílica e a celulose são polares, cobertas de grupos OH que fazem ligações de hidrogênio. Compostos polares (açúcares, aminoácidos, clorofila b) se agarram a elas; os apolares (caroteno, gorduras) quase não. O solvente compete pelos mesmos sítios: um solvente mais polar desloca os compostos polares e os leva mais longe. Assim, numa placa de sílica o hexano só move compostos apolares, o acetato de etila move os moderadamente polares, e o etanol ou a água movem quase tudo o que se dissolve. Colunas de fase reversa, revestidas de longas cadeias de hidrocarboneto, invertem isso: nelas, os compostos apolares é que grudam.
Valores Rf
No papel ou numa placa de camada delgada, o solvente sobe a partir de baixo e a corrida é interrompida antes de ele chegar ao topo. Cada mancha percorreu uma fração fixa da distância do solvente:
Rf = distância percorrida pela mancha ÷ distância percorrida pela frente do solvente = 1 ÷ (1 + k)
As duas distâncias são medidas a partir da linha de base onde a amostra foi aplicada. Rf fica entre 0 e 1, e para uma dada placa, solvente e temperatura cada composto tem mais ou menos o mesmo Rf toda vez, então uma mancha desconhecida pode ser comparada com um padrão corrido ao lado.
Um exemplo resolvido
Um extrato de espinafre é corrido numa placa de sílica com hexano e acetona, 9 para 1. A frente para a 6,0 cm acima da linha de base.
- Uma mancha laranja a 5,7 cm: Rf = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, β-caroteno, o pigmento menos polar.
- Uma mancha verde-azulada a 2,7 cm: Rf = 0,45, clorofila a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
- Uma mancha verde-amarelada a 2,1 cm: Rf = 0,35, clorofila b, que tem um grupo C=O a mais e é mais polar.
- Uma mancha amarela a 1,5 cm: Rf = 0,25, as xantofilas, com grupos OH que se prendem à sílica.
A ordem segue a polaridade, com o menos polar no alto. Os valores publicados para esses pigmentos variam de laboratório para laboratório com a placa, a mistura de solventes e o quanto a placa está seca, e é por isso que se correm padrões ao lado.
Colunas e cromatogramas
Na cromatografia em coluna (e na HPLC e na cromatografia gasosa), a fase móvel escoa por um tubo recheado e os compostos saem no fim um após o outro, num detector que desenha um pico para cada um. O próprio solvente leva o tempo morto t₀ para atravessar; um composto com fator de retenção k leva
tR = t₀ (1 + k)
Os picos se alargam no caminho, porque as moléculas seguem trajetos diferentes pelo recheio e se difundem. A eficiência de uma coluna é seu número de pratos teóricos N: a largura do pico (desvio-padrão) é σ = tR ÷ √N. Uma boa coluna de HPLC tem 10.000 pratos ou mais; uma coluna por gravidade empacotada à mão, talvez algumas centenas.
Continuando o exemplo numa coluna com t₀ = 2,7 min e N = 2.000: a clorofila a (k = 1,22) sai em 2,7 × 2,22 = 6,0 min com σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 min; a clorofila b (k = 1,86), em 7,7 min com σ = 0,17 min.
Resolução
Se dois vizinhos estão separados depende tanto da distância entre eles quanto das suas larguras:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), com a largura de base w = 4σ
Para as duas clorofilas, Rs = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: bem separadas. Rs = 1,5 dá separação até a linha de base; com 1, os picos se sobrepõem cerca de 2 %; abaixo disso eles se fundem. A equação de Purnell mostra as três formas de melhorá-la:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
com α = k₂ ÷ k₁. Uma coluna melhor (N maior) só ajuda com a raiz quadrada; trocar o solvente para mudar α, o quanto os dois compostos grudam de forma diferente, costuma ajudar muito mais.
Como usar a simulação
No Simulador de cromatografia, experimente:
- Pigmentos de folha em hexano e acetona, depois em hexano puro: no hexano só o caroteno se move; as clorofilas ficam perto da linha de base.
- Tinta preta em água: os corantes se separam; em hexano eles não se movem nada, porque não se dissolvem.
- Aminoácidos em butanol, ácido acético e água: nada aparece até você marcar Revelar com ninidrina, e então a leucina e a fenilalanina quase se sobrepõem.
- Faça a mancha com 6 mm: todas as manchas crescem e as vizinhas se fundem.
- Na coluna, baixe N de 2.000 para 200 e veja os picos se alargarem e a resolução cair.
O que o modelo supõe
- Uma única escala de polaridade. Cada composto tem um número de polaridade, escolhido para que seu Rf coincida com um valor publicado num solvente de referência, e cada solvente tem um numa escala de 0 a 1; k = e8(p − s). A retenção real depende de ligações de hidrogênio, acidez, tamanho e forma, não de um número só.
- Solubilidade como chave liga-desliga. Os corantes da tinta só se dissolvem em solventes polares, os pigmentos de folha em qualquer um menos a água, os aminoácidos só em solventes bem polares; fora isso, Rf = 0.
- A mesma fase estacionária para papel, camada delgada e coluna.
- Uma frente que sobe com a raiz quadrada do tempo (a lei de Lucas-Washburn), a uma velocidade que depende do solvente.
- Manchas e picos gaussianos, que se alargam com a distância por difusão; quantidades pequenas, então sem sobrecarga.
- Uma coluna de 25 cm, com 4,6 mm de diâmetro e 65 % de espaço livre, então t₀ = 2,7 mL ÷ a vazão.
Casos-limite
- Rf perto de 0 ou de 1: os compostos se amontoam na linha de base ou na frente e não dá para distingui-los. Mire em valores de Rf entre cerca de 0,2 e 0,8 escolhendo o solvente.
- Solvente acima da linha de base: as manchas se dissolvem no solvente do fundo em vez de correr.
- Compostos incolores precisam de um revelador (ninidrina para aminoácidos, vapor de iodo, luz ultravioleta numa placa fluorescente) para serem vistos.
- Rf idêntico não prova que dois compostos são iguais; corra-os num segundo solvente, ou lado a lado e misturados (co-aplicação).
Onde o modelo deixa de valer
- Cauda e sobrecarga. Amostra demais, ou compostos ácidos e básicos em sílica, dão rastros e manchas em forma de cometa em vez de círculos limpos.
- Misturas de solventes se separam sozinhas. A parte mais polar de uma mistura fica retida pela placa, então a composição do solvente muda ao longo da placa, e uma cuba seca e não saturada deixa o solvente evaporar da placa enquanto sobe; as duas coisas deslocam os valores de Rf.
- Temperatura e umidade mudam o Rf, e a sílica que absorveu água do ar fica menos ativa.
- A eluição em gradiente, em que o solvente fica aos poucos mais forte durante uma corrida em coluna, é como se faz a maior parte da HPLC; este modelo mantém o solvente fixo.
- Outros mecanismos. As cromatografias de troca iônica, de exclusão por tamanho e de afinidade separam por carga, tamanho e ligação específica, não por polaridade.
Ferramentas relacionadas
O Simulador de eletroforese em gel separa DNA por tamanho, outra maneira de desmontar uma mistura; o Simulador de espectrofotômetro e lei de Beer-Lambert mostra como um detector mede quanto de um composto sai; e o Visualizador de moléculas 3D mostra os grupos polares que fazem as moléculas grudarem.