So funktioniert Chromatografie: Rf-Werte, Säulen und Auflösung

Zwei Phasen

Jede Art von Chromatografie hat eine stationäre Phase, die an ihrem Platz bleibt (die Cellulose des Papiers, das Kieselgel einer DC-Platte, die Füllung einer Säule), und eine mobile Phase, die an ihr vorbeiströmt (ein Lösungsmittel oder, in der Gaschromatografie, ein Gas). Jede Verbindung im Gemisch wechselt ständig zwischen beiden: Gelöst in der mobilen Phase wandert sie, an der stationären Phase haftend wartet sie. Eine Verbindung, die mehr Zeit haftend verbringt, wandert langsamer, also trennen sich Verbindungen, die unterschiedlich stark haften.

Das Verhältnis von Haftzeit zu Wanderzeit ist der Retentionsfaktor k. Eine Verbindung mit k = 1 wandert die Hälfte der Zeit und kommt mit halber Geschwindigkeit des Lösungsmittels voran.

Polarität

Kieselgel und Cellulose sind polar, bedeckt mit OH-Gruppen, die Wasserstoffbrücken bilden. Polare Verbindungen (Zucker, Aminosäuren, Chlorophyll b) haften an ihnen; unpolare (Carotin, Fette) kaum. Das Lösungsmittel konkurriert um dieselben Stellen: Ein polareres Lösungsmittel verdrängt polare Verbindungen und trägt sie weiter. Auf einer Kieselgelplatte bewegt Hexan also nur unpolare Verbindungen, Essigsäureethylester mäßig polare, und Ethanol oder Wasser bewegen fast alles, was sich löst. Umkehrphasen-Säulen, mit langen Kohlenwasserstoffketten beschichtet, drehen das um: Dort haften die unpolaren Verbindungen.

Rf-Werte

Auf Papier oder einer DC-Platte kriecht das Lösungsmittel von unten nach oben, und der Lauf wird gestoppt, bevor es oben ankommt. Jeder Fleck hat einen festen Bruchteil der Strecke des Lösungsmittels zurückgelegt:

R_f = Laufstrecke des Flecks ÷ Laufstrecke der Lösungsmittelfront = 1 ÷ (1 + k)

Beide Strecken werden von der Startlinie aus gemessen, auf die die Probe aufgetragen wurde. R_f liegt zwischen 0 und 1, und für eine bestimmte Platte, ein Lösungsmittel und eine Temperatur hat jede Verbindung jedes Mal etwa denselben R_f, sodass sich ein unbekannter Fleck mit einem Standard vergleichen lässt, der daneben läuft.

Ein Rechenbeispiel

Ein Spinatextrakt läuft auf einer Kieselgelplatte in Hexan und Aceton, 9 zu 1. Die Front bleibt 6,0 cm über der Startlinie stehen.

1. Ein orangefarbener Fleck bei 5,7 cm: R_f = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95, β-Carotin, das am wenigsten polare Pigment.
2. Ein blaugrüner Fleck bei 2,7 cm: R_f = 0,45, Chlorophyll a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
3. Ein gelbgrüner Fleck bei 2,1 cm: R_f = 0,35, Chlorophyll b, das eine zusätzliche C=O-Gruppe hat und polarer ist.
4. Ein gelber Fleck bei 1,5 cm: R_f = 0,25, die Xanthophylle, deren OH-Gruppen das Kieselgel festhalten.

Die Reihenfolge folgt der Polarität, das am wenigsten polare oben. Veröffentlichte Werte für diese Pigmente schwanken von Labor zu Labor mit Platte, Lösungsmittelgemisch und Trockenheit der Platte, darum lässt man Standards daneben laufen.

Säulen und Chromatogramme

In der Säulenchromatografie (und in HPLC und Gaschromatografie) strömt die mobile Phase durch ein gefülltes Rohr, und die Verbindungen kommen am Ende nacheinander heraus, in einen Detektor, der für jede einen Peak zeichnet. Das Lösungsmittel selbst braucht die Totzeit t₀ für den Durchgang; eine Verbindung mit dem Retentionsfaktor k braucht

t_R = t₀ (1 + k)

Peaks werden unterwegs breiter, weil Moleküle verschiedene Wege durch die Füllung nehmen und diffundieren. Die Effizienz einer Säule ist ihre Zahl theoretischer Böden N: Die Peakbreite (Standardabweichung) ist σ = t_R ÷ √N. Eine gute HPLC-Säule hat 10.000 Böden oder mehr; eine von Hand gepackte Schwerkraftsäule vielleicht einige hundert.

Weiter mit dem Beispiel auf einer Säule mit t₀ = 2,7 min und N = 2.000: Chlorophyll a (k = 1,22) kommt nach 2,7 × 2,22 = 6,0 min mit σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 min heraus; Chlorophyll b (k = 1,86) nach 7,7 min mit σ = 0,17 min.

Auflösung

Ob zwei Nachbarn getrennt sind, hängt vom Abstand zwischen ihnen und von ihren Breiten ab:

R_s = 2 (t_R2 − t_R1) ÷ (w₁ + w₂), mit der Basisbreite w = 4σ

Für die beiden Chlorophylle ist R_s = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: sauber getrennt. R_s = 1,5 bedeutet Trennung bis zur Basislinie; bei 1 überlappen die Peaks um etwa 2 %; darunter verschmelzen sie. Die Purnell-Gleichung zeigt die drei Wege, sie zu verbessern:

R_s = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))

mit α = k₂ ÷ k₁. Eine bessere Säule (größeres N) hilft nur mit der Quadratwurzel; ein anderes Lösungsmittel, das α ändert, also wie unterschiedlich die beiden Verbindungen haften, hilft meist weit mehr.

Die Simulation benutzen

Im Chromatografie-Simulator kannst du ausprobieren:

• Blattpigmente in Hexan und Aceton, dann in reinem Hexan: In Hexan bewegt sich nur Carotin; die Chlorophylle bleiben nahe der Startlinie.
• Schwarze Tinte in Wasser: Die Farbstoffe trennen sich; in Hexan bewegen sie sich gar nicht, weil sie sich nicht lösen.
• Aminosäuren in Butanol, Essigsäure und Wasser: Nichts ist zu sehen, bis du Mit Ninhydrin anfärben anhakst; dann überlappen Leucin und Phenylalanin fast.
• Mach den Fleck 6 mm breit: Jeder Fleck wächst, und Nachbarn verschmelzen.
• Senke an der Säule N von 2.000 auf 200 und sieh zu, wie die Peaks breiter werden und die Auflösung fällt.

Was das Modell annimmt

• Eine einzige Polaritätsskala. Jede Verbindung hat eine Polaritätszahl, so gewählt, dass ihr R_f in einem Referenzlösungsmittel einem veröffentlichten Wert entspricht, und jedes Lösungsmittel hat eine auf einer Skala von 0 bis 1; k = e^{8(p − s)}. Echte Retention hängt von Wasserstoffbrücken, Acidität, Größe und Form ab, nicht von einer Zahl.
• Löslichkeit als Schalter. Tintenfarbstoffe lösen sich nur in polaren Lösungsmitteln, Blattpigmente in allem außer Wasser, Aminosäuren nur in ziemlich polaren Lösungsmitteln; sonst ist R_f = 0.
• Dieselbe stationäre Phase für Papier, DC und Säule.
• Eine Front, die mit der Quadratwurzel der Zeit steigt (das Lucas-Washburn-Gesetz), mit einer Geschwindigkeit, die vom Lösungsmittel abhängt.
• Gaußförmige Flecken und Peaks, die mit der Strecke durch Diffusion breiter werden; kleine Mengen, also keine Überladung.
• Eine 25-cm-Säule mit 4,6 mm Durchmesser und 65 % freiem Raum, also t₀ = 2,7 mL ÷ Flussrate.

Grenzfälle

• R_f nahe 0 oder 1: Die Verbindungen stauen sich an der Startlinie oder an der Front und lassen sich nicht unterscheiden. Ziel sind R_f-Werte zwischen etwa 0,2 und 0,8, erreicht durch die Wahl des Lösungsmittels.
• Lösungsmittel über der Startlinie: Die Flecken waschen unten ins Lösungsmittel aus, statt zu laufen.
• Farblose Verbindungen brauchen ein Färbereagenz (Ninhydrin für Aminosäuren, Ioddampf, UV-Licht auf einer fluoreszierenden Platte), um überhaupt sichtbar zu werden.
• Gleicher R_f beweist nicht, dass zwei Verbindungen identisch sind; lass sie in einem zweiten Lösungsmittel laufen oder nebeneinander und gemischt (Co-Spotting).

Wo das Modell nicht mehr stimmt

• Tailing und Überladung. Zu viel Probe, oder saure und basische Verbindungen auf Kieselgel, ergeben Schlieren und kometenförmige Flecken statt sauberer Kreise.
• Lösungsmittelgemische trennen sich selbst. Der polarere Teil eines Gemischs wird von der Platte zurückgehalten, sodass sich die Zusammensetzung des Lösungsmittels die Platte hinauf ändert, und eine trockene, ungesättigte Kammer lässt das Lösungsmittel beim Aufsteigen von der Platte verdunsten; beides verschiebt die R_f-Werte.
• Temperatur und Luftfeuchtigkeit ändern R_f, und Kieselgel, das Wasser aus der Luft aufgenommen hat, wird weniger aktiv.
• Gradientenelution, bei der das Lösungsmittel während eines Säulenlaufs allmählich stärker wird, ist die übliche Arbeitsweise in der HPLC; dieses Modell hält das Lösungsmittel fest.
• Andere Mechanismen. Ionenaustausch-, Größenausschluss- und Affinitätschromatografie trennen nach Ladung, Größe und spezifischer Bindung, nicht nach Polarität.

Passende Tools

Der Gelelektrophorese-Simulator trennt DNA nach Größe, ein anderer Weg, ein Gemisch zu zerlegen; der Simulator für Spektralphotometer und das Lambert-Beer-Gesetz zeigt, wie ein Detektor misst, wie viel von einer Verbindung herauskommt; und der 3D-Molekülbetrachter zeigt die polaren Gruppen, die Moleküle haften lassen.