크로마토그래피의 원리: 종이와 박층의 Rf 값, 칼럼 머무름 시간과 분리능

두 개의 상

모든 크로마토그래피에는 제자리에 머무는 정지상(종이의 셀룰로스, 박층판의 실리카겔, 칼럼의 충전제)과 그 위를 흐르는 이동상(용매, 또는 기체 크로마토그래피의 기체)이 있습니다. 혼합물의 각 화합물은 끊임없이 두 상을 오갑니다. 이동상에 녹아 있을 때는 나아가고, 정지상에 붙어 있을 때는 기다립니다. 붙어 있는 시간이 긴 화합물일수록 느리게 이동하므로, 붙는 세기가 다른 화합물끼리 갈라집니다.

붙어 있는 시간과 움직이는 시간의 비가 머무름 인자 k입니다. k = 1인 화합물은 시간의 절반만 움직이므로 용매 속력의 절반으로 나아갑니다.

극성

실리카와 셀룰로스는 극성이 있으며, 수소 결합을 하는 OH기로 덮여 있습니다. 극성 화합물(당, 아미노산, 엽록소 b)은 여기에 달라붙고, 무극성 화합물(카로틴, 지방)은 거의 붙지 않습니다. 용매도 같은 자리를 두고 경쟁하므로, 극성이 큰 용매일수록 극성 화합물을 밀어내고 더 멀리 실어 갑니다. 그래서 실리카 판에서 헥산은 무극성 화합물만, 아세트산 에틸은 중간 정도 극성의 화합물을, 에탄올이나 물은 녹는 것은 거의 모두 움직입니다. 긴 탄화수소 사슬을 입힌 역상 칼럼에서는 이것이 뒤집혀 무극성 화합물이 달라붙습니다.

Rf 값

종이나 박층판에서는 용매가 아래에서 스며 올라가고, 위쪽 끝에 닿기 전에 전개를 멈춥니다. 각 점은 용매가 간 거리의 일정한 비율만큼 이동해 있습니다.

R_f = 점이 이동한 거리 ÷ 용매 끝이 이동한 거리 = 1 ÷ (1 + k)

두 거리 모두 시료를 찍은 출발선에서 잽니다. R_f는 0과 1 사이 값이며, 판, 용매, 온도가 같으면 각 화합물은 매번 거의 같은 R_f를 보이므로, 모르는 점을 옆에서 함께 전개한 표준과 비교할 수 있습니다.

계산 예

시금치 추출물을 실리카 판에서 헥산과 아세톤 9:1로 전개합니다. 용매 끝은 출발선에서 6.0 cm 위에서 멈춥니다.

5.7 cm의 주황색 점: R_f = 5.7 ÷ 6.0 = 0.95, 극성이 가장 낮은 색소인 β-카로틴입니다.
2.7 cm의 청록색 점: R_f = 0.45, 엽록소 a; k = 1 ÷ 0.45 − 1 = 1.2.
2.1 cm의 황록색 점: R_f = 0.35, 엽록소 b로, C=O기가 하나 더 있어 극성이 더 큽니다.
1.5 cm의 노란색 점: R_f = 0.25, 잔토필류로, OH기가 실리카를 붙잡습니다.

순서는 극성을 따르며, 극성이 가장 낮은 것이 맨 위에 있습니다. 이 색소들에 대해 발표된 값은 판, 용매 혼합비, 판이 마른 정도에 따라 실험실마다 다르므로, 표준을 옆에서 함께 전개합니다.

칼럼과 크로마토그램

칼럼 크로마토그래피(HPLC와 기체 크로마토그래피도 마찬가지)에서는 이동상이 충전된 관을 흐르고, 화합물이 끝에서 하나씩 빠져나와 검출기로 들어가며 각각 봉우리를 그립니다. 용매 자체가 통과하는 데 걸리는 시간이 불감 시간 t₀이고, 머무름 인자가 k인 화합물이 걸리는 시간은

t_R = t₀ (1 + k)

분자들이 충전제 속을 서로 다른 경로로 지나고 확산하기 때문에 봉우리는 가면서 넓어집니다. 칼럼의 효율은 이론단 수 N으로 나타내며, 봉우리 너비(표준 편차)는 σ = t_R ÷ √N입니다. 좋은 HPLC 칼럼은 10,000단 이상이고, 손으로 채운 중력식 칼럼은 아마 수백 단입니다.

예를 이어서 t₀ = 2.7분, N = 2,000인 칼럼에서는 엽록소 a(k = 1.22)가 2.7 × 2.22 = 6.0분에 σ = 6.0 ÷ √2000 = 0.13분으로, 엽록소 b(k = 1.86)가 7.7분에 σ = 0.17분으로 나옵니다.

분리능

이웃한 둘이 갈라졌는지는 둘 사이의 간격과 너비 모두에 달려 있습니다.

R_s = 2 (t_R2 − t_R1) ÷ (w₁ + w₂), 바탕 너비 w = 4σ

두 엽록소는 R_s = 2 × 1.72 ÷ (0.54 + 0.69) = 2.8로 깨끗하게 갈라집니다. R_s = 1.5면 바탕선까지 분리되고, 1이면 봉우리가 약 2% 겹치며, 그보다 낮으면 합쳐집니다. 퍼넬 식은 분리능을 높이는 세 가지 방법을 보여 줍니다.

R_s = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))

여기서 α = k₂ ÷ k₁입니다. 더 좋은 칼럼(큰 N)은 제곱근만큼만 도움이 됩니다. 용매를 바꿔 α, 곧 두 화합물이 붙는 정도의 차이를 바꾸는 편이 보통 훨씬 효과적입니다.

시뮬레이션 사용법

크로마토그래피 시뮬레이터에서 해 볼 만한 것:

잎 색소를 헥산과 아세톤에서, 그다음 순수한 헥산에서 전개하기: 헥산에서는 카로틴만 움직이고 엽록소는 출발선 근처에 머뭅니다.
검은 잉크를 물에서 전개하기: 염료가 갈라집니다. 헥산에서는 녹지 않으므로 전혀 움직이지 않습니다.
아미노산을 부탄올, 아세트산, 물에서 전개하기: 닌하이드린으로 발색을 체크하기 전에는 아무것도 보이지 않고, 체크하면 류신과 페닐알라닌이 거의 겹쳐 있습니다.
점의 지름을 6 mm로 하기: 모든 점이 커지고 이웃끼리 합쳐집니다.
칼럼에서 N을 2,000에서 200으로 낮추기: 봉우리가 넓어지고 분리능이 떨어집니다.

모형의 가정

하나의 극성 척도. 각 화합물에는 한 기준 용매에서의 R_f가 발표된 값과 맞도록 고른 극성 값이 하나 있고, 각 용매에도 0~1 척도의 값이 하나 있습니다. k = e^{8(p − s)}입니다. 실제 머무름은 수소 결합, 산성도, 크기, 모양에 따라 달라지며 숫자 하나로 정해지지 않습니다.
녹거나 안 녹거나. 잉크 염료는 극성 용매에만, 잎 색소는 물을 뺀 모든 용매에, 아미노산은 꽤 극성인 용매에만 녹으며, 그 밖에는 R_f = 0입니다.
같은 정지상을 종이, 박층, 칼럼에 씁니다.
시간의 제곱근에 비례해 올라가는 용매 끝(루카스-워시번 법칙)이며, 속력은 용매에 따라 다릅니다.
가우스 모양의 점과 봉우리로, 확산 때문에 거리에 따라 넓어집니다. 시료는 소량이라 과부하가 없습니다.
길이 25 cm 칼럼, 내경 4.6 mm, 빈 공간 65%이므로 t₀ = 2.7 mL ÷ 유량입니다.

경계 사례

R_f가 0이나 1에 가까움: 화합물이 출발선이나 용매 끝에 몰려 구별할 수 없습니다. 용매를 골라 R_f가 약 0.2~0.8이 되게 하세요.
용매가 출발선보다 높음: 점이 올라가지 않고 바닥의 용매로 녹아 나옵니다.
무색 화합물은 발색제(아미노산에는 닌하이드린, 아이오딘 증기, 형광 판에 비추는 자외선)가 있어야 보입니다.
같은 R_f가 두 화합물이 같다는 증거는 아닙니다. 다른 용매에서도 전개하거나, 나란히 그리고 섞어서(공동 점적) 전개하세요.

모형이 맞지 않게 되는 경우

꼬리 끌기와 과부하. 시료가 너무 많거나, 산성·염기성 화합물을 실리카에서 전개하면 깔끔한 원 대신 줄무늬와 혜성 모양의 점이 생깁니다.
혼합 용매는 스스로도 갈라집니다. 혼합물 중 극성이 큰 성분이 판에 붙잡히므로 위로 갈수록 용매 조성이 바뀌고, 전개조가 마르고 포화되지 않으면 올라가는 동안 용매가 판에서 증발합니다. 둘 다 R_f를 바꿉니다.
온도와 습도가 R_f를 바꾸며, 공기 중 수분을 먹은 실리카는 활성이 떨어집니다.
기울기 용리, 곧 칼럼 전개 중에 용매를 점점 세게 하는 방식이 HPLC에서는 일반적이지만, 이 모형은 용매를 고정합니다.
다른 원리. 이온 교환, 크기 배제, 친화 크로마토그래피는 극성이 아니라 전하, 크기, 특이적 결합으로 나눕니다.

크로마토그래피의 원리: Rf 값, 칼럼, 분리능