Das Lambert-Beer-Gesetz erklärt: Extinktion, Spektralphotometer und Kalibriergeraden

Wie ein Spektralphotometer arbeitet

Eine Lampe liefert weißes Licht (eine Wolframlampe für den sichtbaren Bereich, eine Deuteriumlampe für das Ultraviolett). Ein Monochromator, ein Prisma oder Beugungsgitter mit einem Spalt, wählt ein schmales Wellenlängenband aus. Dieses Licht geht durch die Probe in einer Küvette und trifft auf einen Detektor. Zuerst wird ein Leerwert gemessen, die Küvette nur mit dem Lösungsmittel, er liefert I₀; dann liefert die Probe I. Teilt man das eine durch das andere, fallen die Helligkeit der Lampe, die Reflexionen der Küvette und die Eigenabsorption des Lösungsmittels heraus.

Transmission und Extinktion

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

Die Transmission ist der Anteil des Lichts, der durchkommt. Die Extinktion (Absorbanz) ist ihr negativer Logarithmus. Sie verwandelt die Art, wie Licht in einer Probe abklingt, um denselben Bruchteil in jedem Millimeter, in eine Zahl, die linear mit der Menge des absorbierenden Stoffs wächst:

• A = 0: Das ganze Licht kommt durch.
• A = 1: 10 % kommen durch.
• A = 2: 1 %. A = 3: 0,1 %.

Das Lambert-Beer-Gesetz

A = ε l c

• ε ist der Absorptionskoeffizient des Stoffs bei dieser Wellenlänge: wie stark er absorbiert. In M⁻¹ cm⁻¹ ist es der molare Extinktionskoeffizient.
• l ist die Schichtdicke durch die Probe, 1 cm in einer Standardküvette.
• c ist die Konzentration.

Doppelte Konzentration oder Schichtdicke verdoppelt die Extinktion. Mit dem Gesetz lässt sich eine gemessene Extinktion direkt in eine Konzentration umrechnen, wenn ε bekannt ist.

Rechenbeispiele

1. Kaliumpermanganat hat ε = 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ bei 525 nm. Eine 80-µM-Lösung in einer 1-cm-Küvette: A = 2.455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10^−0,196 = 63,7 %.
2. Protein: Rinderserumalbumin absorbiert bei 280 nm 0,667 pro mg/mL und cm, durch sein Tryptophan und Tyrosin. Ein Messwert von 0,40 bedeutet 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL.
3. DNA: Doppelsträngige DNA mit 50 µg/mL ergibt A₂₆₀ = 1,0. Eine 1 zu 10 verdünnte Probe, die 0,25 anzeigt, enthält 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. Reine DNA hat ein A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ von etwa 1,8; ein niedrigerer Wert deutet auf Protein in der Probe hin.

Absorptionsspektren

Trägst du die Extinktion gegen die Wellenlänge auf, erhältst du das Absorptionsspektrum des Stoffs. Miss an seinem Maximum, λ_max: Dort ist der Messwert am größten, also am empfindlichsten, und die Kurve ist flach, sodass kleine Fehler in der Wellenlänge am wenigsten ausmachen. Eine Lösung hat die Farbe des Lichts, das sie nicht absorbiert: Permanganat absorbiert Grün (um 525 nm) und sieht violett aus; Kupfersulfat absorbiert Rot und nahes Infrarot (um 800 nm) und sieht hellblau aus.

Kalibriergeraden

Oft ist ε für die genaue Probe und die Bedingungen nicht bekannt, oder das Gerät muss überprüft werden. Dann misst man eine Reihe von Standards bekannter Konzentration, trägt die Extinktion gegen die Konzentration auf und legt eine Gerade A = m c + b hindurch. Die Konzentration einer Unbekannten ist c = (A − b) ÷ m.

Beispiel: Permanganat-Standards mit 0, 25, 50 und 100 µM zeigen 0,000, 0,061, 0,123 und 0,245. Die Steigung der Ausgleichsgeraden ist 0,00245 pro µM mit einem Achsenabschnitt nahe null. Eine Unbekannte mit 0,150 hat 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM. Trau dem Ergebnis nur innerhalb des Bereichs der Standards und nur, wenn R² nahe 1 liegt.

Die Simulation benutzen

Im Simulator für Spektralphotometer und das Lambert-Beer-Gesetz kannst du ausprobieren:

• Permanganat am Maximum: Verdopple die Konzentration, und die Extinktion verdoppelt sich, während die Transmission von 64 % auf 41 % fällt.
• Halbiere die Schichtdicke: Die Extinktion halbiert sich.
• Dreh die Konzentration ganz auf: Die gemessene Extinktion fällt unter die Lambert-Beer-Gerade und flacht wegen des Streulichts nahe 3 ab. Nimm den Haken bei 0,1 % Streulicht einbeziehen heraus, und beide stimmen überein.
• Verbreitere den Spalt bei den schmalen Peaks des Permanganats auf 20 nm: Die Extinktion am Maximum sinkt und das Spektrum glättet sich.
• Wähle DNA bei 260 nm in einer Kunststoffküvette: Die Küvette schluckt fast das ganze Ultraviolett, und der Messwert wird zu Rauschen.
• Füge vier Standards hinzu, miss die Unbekannte und vergleiche das Ergebnis mit dem angezeigten tatsächlichen Wert.

Was das Modell annimmt

• Absorptionsspektren aus glatten Peaks, skaliert auf veröffentlichte Werte bei einer Wellenlänge: Permanganat 2.455 M⁻¹ cm⁻¹ bei 525 nm, Kupfersulfat etwa 12,5 M⁻¹ cm⁻¹ bei 810 nm, Albumin 0,667 pro mg/mL bei 280 nm, DNA 0,020 pro µg/mL bei 260 nm. Die Formen an anderen Stellen sind Näherungen.
• Ein dreieckiges Spaltband: Der Messwert mittelt die Transmission über ± die Spaltbreite.
• Streulicht von 0,1 %, das den Detektor erreicht, ohne bei der gewählten Wellenlänge durch den absorbierenden Stoff zu gehen.
• Küvetten: Quarz lässt ab 200 nm überall Licht durch; Polystyrol lässt unter etwa 300 nm nichts mehr durch.
• Etwas Detektorrauschen, sodass die Messwerte in der letzten Stelle schwanken und unzuverlässig werden, wenn fast kein Licht durchkommt.
• Der Leerwert hebt Küvette und Lösungsmittel exakt auf, und die Unbekannte bekommt für jede Lösung nach Zurücksetzen eine neue zufällige Konzentration.

Grenzfälle

• Konzentration null ergibt A = 0, bis auf Rauschen, weil der Leerwert dieselbe Küvette und dasselbe Lösungsmittel ist.
• Wellenlängen, bei denen nichts absorbiert, ergeben bei jeder Konzentration A ≈ 0; Kupfersulfat absorbiert im Grünen kaum.
• Sehr hohe Extinktion erreicht eine Obergrenze nahe −log₁₀ des Streulichts: etwa 3 bei 0,1 %.
• Standards bei einer Wellenlänge, die Unbekannte bei einer anderen, ergeben ein sinnloses Ergebnis; die Simulation warnt davor.

Wo das Modell nicht mehr stimmt

• Konzentrierte Lösungen. Über etwa 10 mM liegen die Moleküle so dicht, dass sie die Absorption der anderen beeinflussen, und der Brechungsindex ändert sich; die Gerade krümmt sich selbst mit einem perfekten Gerät.
• Chemie in der Küvette. Farbstoffe, die sich paaren, Säuren und Basen, deren Farbe vom pH abhängt, und Komplexe, die beim Verdünnen zerfallen, ändern alle ε mit der Konzentration.
• Streuung. Trübe Proben, Zellen und Niederschläge streuen Licht am Detektor vorbei, was als Extinktion erscheint, die gar nicht da ist; genau das misst die OD600 einer Bakterienkultur absichtlich.
• Fluoreszenz. Eine Probe, die einen Teil des Lichts wieder aussendet, kann es zum Detektor schicken und einen zu niedrigen Wert liefern.
• Proteine unterscheiden sich. Der Wert 0,667 gilt für Albumin; andere Proteine enthalten andere Mengen Tryptophan und Tyrosin und können pro mg/mL halb oder doppelt so stark absorbieren.

Rechner

Löse A = εlc nach jeder Größe auf mit dem Rechner für das Lambert-Beer-Gesetz, werte eigene Messungen mit dem Standardkurven-Rechner aus, und berechne Nukleinsäure- und Proteinkonzentrationen mit dem DNA-Konzentrationsrechner und Proteinkonzentration berechnen (A280). Die Anleitungen Eine Standardkurve erstellen und Proteinkonzentration bei A280 messen gehen weiter.