Закон Бугера — Ламберта — Бера: оптическая плотность, спектрофотометры и калибровочные кривые

Как работает спектрофотометр

Лампа даёт белый свет (вольфрамовая лампа для видимого диапазона, дейтериевая для ультрафиолета). Монохроматор — призма или дифракционная решётка со щелью — выделяет узкую полосу длин волн. Этот свет проходит через образец в кювете и попадает на детектор. Сначала измеряют холостую пробу, кювету только с растворителем, чтобы получить I₀; затем образец даёт I. Деление одного на другое убирает яркость лампы, отражения кюветы и собственное поглощение растворителя.

Пропускание и оптическая плотность

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

Пропускание — доля прошедшего света. Оптическая плотность (поглощение, absorbance) — его отрицательный логарифм, который превращает то, как свет гаснет в образце, на одну и ту же долю на каждом миллиметре, в число, растущее линейно с количеством поглощающего вещества:

• A = 0: проходит весь свет.
• A = 1: проходит 10%.
• A = 2: 1%. A = 3: 0,1%.

Закон Бугера — Ламберта — Бера

A = ε l c

• ε — коэффициент поглощения вещества на этой длине волны: насколько сильно оно поглощает. В М⁻¹ см⁻¹ это молярный коэффициент поглощения, или коэффициент экстинкции.
• l — длина оптического пути через образец, 1 см в стандартной кювете.
• c — концентрация.

Удвойте концентрацию или путь, и оптическая плотность удвоится. Закон позволяет сразу перевести измеренную оптическую плотность в концентрацию, если ε известен.

Разобранные примеры

1. Перманганат калия имеет ε = 2455 М⁻¹ см⁻¹ при 525 нм. Раствор 80 мкМ в кювете 1 см: A = 2455 × 1 × 0,000080 = 0,196, T = 10^−0,196 = 63,7%.
2. Белок: бычий сывороточный альбумин поглощает 0,667 на мг/мл на см при 280 нм за счёт триптофана и тирозина. Показание 0,40 означает 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 мг/мл.
3. ДНК: двуцепочечная ДНК в концентрации 50 мкг/мл даёт A₂₆₀ = 1,0. Образец, разведённый 1 к 10, с показанием 0,25 содержит 0,25 × 50 × 10 = 125 мкг/мл. У чистой ДНК A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ около 1,8; более низкое отношение указывает на примесь белка.

Спектры поглощения

График оптической плотности от длины волны — спектр поглощения вещества. Измеряйте в его максимуме, λ_max: показание там наибольшее, то есть самое чувствительное, а кривая пологая, так что мелкие ошибки длины волны важны меньше всего. Раствор выглядит цветом того света, который он не поглощает: перманганат поглощает зелёный (около 525 нм) и выглядит фиолетовым; медный купорос поглощает красный и ближний инфракрасный (около 800 нм) и выглядит бледно-голубым.

Калибровочные кривые

Часто ε для конкретного образца и условий неизвестен или прибор нужно проверить. Тогда измеряют серию стандартов известной концентрации, строят оптическую плотность против концентрации и проводят прямую A = m c + b. Концентрация неизвестного c = (A − b) ÷ m.

Пример: стандарты перманганата 0, 25, 50 и 100 мкМ дают 0,000, 0,061, 0,123 и 0,245. Наклон прямой 0,00245 на мкМ, свободный член около нуля. Неизвестное с показанием 0,150 — это 0,150 ÷ 0,00245 = 61 мкМ. Доверяйте ответу только внутри диапазона стандартов и только если R² близок к 1.

Как пользоваться симуляцией

В Симулятор спектрофотометра и закона Бугера — Ламберта — Бера попробуйте:

• Перманганат в максимуме: удвойте концентрацию, и оптическая плотность удвоится, а пропускание упадёт с 64% до 41%.
• Уменьшите длину пути вдвое: оптическая плотность уменьшится вдвое.
• Поднимите концентрацию до упора: измеренная оптическая плотность опускается ниже прямой Бугера — Ламберта — Бера и выходит на плато около 3 из-за рассеянного света. Снимите флажок «Учитывать 0,1% рассеянного света», и они совпадут.
• Расширьте щель до 20 нм на узких пиках перманганата: оптическая плотность в максимуме падает, а спектр сглаживается.
• Выберите ДНК при 260 нм в пластиковой кювете: кювета поглощает почти весь ультрафиолет, и показание превращается в шум.
• Добавьте четыре стандарта, измерьте неизвестное и сравните ответ с показанным истинным значением.

Что предполагает модель

• Спектры поглощения собраны из гладких пиков, масштабированных к опубликованным значениям на одной длине волны: перманганат 2455 М⁻¹ см⁻¹ при 525 нм, медный купорос около 12,5 М⁻¹ см⁻¹ при 810 нм, альбумин 0,667 на мг/мл при 280 нм, ДНК 0,020 на мкг/мл при 260 нм. Форма в остальных местах приблизительна.
• Треугольная полоса щели: показание усредняет пропускание в пределах ± ширины щели.
• Рассеянный свет 0,1%, попадающий на детектор, не пройдя через поглощающее вещество на выбранной длине волны.
• Кюветы: кварцевая пропускает везде начиная с 200 нм; полистироловая перестаёт пропускать ниже примерно 300 нм.
• Небольшой шум детектора, поэтому показания дрожат в последнем знаке и становятся ненадёжными, когда почти не проходит света.
• Холостая проба точно компенсирует кювету и растворитель, а неизвестное — новая случайная концентрация для каждого раствора после «Сбросить».

Крайние случаи

• Нулевая концентрация даёт A = 0, не считая шума, потому что холостая проба — та же кювета и растворитель.
• Длины волн, на которых ничего не поглощается, дают A ≈ 0 при любой концентрации; медный купорос почти не поглощает в зелёной области.
• Очень высокая оптическая плотность упирается в потолок около −log₁₀ доли рассеянного света: около 3 для 0,1%.
• Стандарты на одной длине волны, неизвестное на другой дают бессмысленный ответ; симуляция предупреждает.

Где модель перестаёт быть верной

• Концентрированные растворы. Выше примерно 10 мМ молекулы сидят достаточно близко, чтобы влиять на поглощение друг друга, и меняется показатель преломления; прямая искривляется даже при идеальном приборе.
• Химия в кювете. Красители, образующие пары, кислоты и основания, цвет которых зависит от pH, и комплексы, диссоциирующие при разбавлении, меняют ε с концентрацией.
• Рассеяние. Мутные образцы, клетки и осадки рассеивают свет мимо детектора, что читается как несуществующее поглощение; именно это намеренно измеряет показание OD600 бактериальной культуры.
• Флуоресценция. Образец, переизлучающий часть света, может направить её на детектор и дать заниженное показание.
• Белки различаются. Число 0,667 относится к альбумину; у других белков другое количество триптофана и тирозина, и они могут поглощать вдвое меньше или вдвое больше на мг/мл.

Калькуляторы

Решите A = εlc относительно любого члена в Калькулятор закона Бугера — Ламберта — Бера, подгоните свои показания в Калькулятор калибровочной кривой и рассчитайте концентрации нуклеиновых кислот и белков в Калькулятор концентрации ДНК и Калькулятор концентрации белка (A280). Руководства Как построить калибровочную кривую и Как измерить концентрацию белка по A280 идут дальше.