Как работает буфер: уравнение Хендерсона — Хассельбаха, буферная ёмкость и выбор буфера

Что такое буфер

Буфер — это раствор слабой кислоты HA вместе с сопряжённым основанием A⁻: уксусная кислота с ацетатом натрия или дигидрофосфат с гидрофосфатом. Добавьте сильную кислоту, и основание заберёт протоны (A⁻ + H⁺ → HA); добавьте сильное основание, и кислота их отдаст (HA + OH⁻ → A⁻ + H₂O). В обоих случаях добавленная кислота или основание превращается в небольшой сдвиг отношения A⁻ к HA, а не в большое изменение свободных H⁺, поэтому pH почти не меняется. Так поддерживается pH крови 7,4, в основном бикарбонатным буфером, и почти каждый биохимический эксперимент проводится в буфере.

Уравнение Хендерсона — Хассельбаха

pH = pKa + log₁₀([A⁻] ÷ [HA])

pKa = −log₁₀ Ka — pH, при котором кислота диссоциирована наполовину.
Равные количества кислоты и основания: pH = pKa. Основания в десять раз больше: pKa + 1. Кислоты в десять раз больше: pKa − 1.
Поскольку в уравнение входит только отношение, разбавление буфера почти не меняет его pH; но оно его ослабляет.

Разобранный пример

В 100 мл ацетатного буфера 5 ммоль уксусной кислоты и 5 ммоль ацетата натрия (всего 100 мМ, pKa 4,76), поэтому pH = 4,76. Добавим 2 мл 1 М HCl, то есть 2 ммоль H⁺:

H⁺ превращает 2 ммоль ацетата в уксусную кислоту: ацетата 5 − 2 = 3 ммоль, уксусной кислоты 5 + 2 = 7 ммоль.
pH = 4,76 + log₁₀(3 ÷ 7) = 4,76 − 0,37 = 4,39.

Те же 2 ммоль в 100 мл чистой воды дают 2 ммоль в 102 мл, [H⁺] = 0,0196 М, pH = 1,71: падение больше чем на пять единиц против 0,37 у буфера.

Буферная ёмкость

Буферная ёмкость β — сколько сильной кислоты или основания, в молях на литр, нужно, чтобы изменить pH на единицу:

β = 2,303 (Kw ÷ [H⁺] + [H⁺] + C_T Ka [H⁺] ÷ (Ka + [H⁺])²)

Последнее слагаемое, вклад самого буфера, максимально при pH = pKa, где оно равно 2,303 × C_T ÷ 4 = 0,576 C_T. Поэтому буфер лучше всего работает при своём pKa, приемлемо — в пределах примерно 1 единицы от него, а его ёмкость пропорциональна общей концентрации C_T: 100 мМ сопротивляются в десять раз сильнее, чем 10 мМ. Когда одна из форм израсходована, буферу больше нечего отдать, и pH уходит, как в воде.

Выбор буфера

Ацетатный, pKa 4,76: pH от 3,8 до 5,8.
Бикарбонатный, pKa 6,35 (для CO₂ + H₂O ⇌ H⁺ + HCO₃⁻): кровь и среды для культур клеток, где растворённый CO₂ держится в равновесии с воздухом.
Фосфатный, pKa 7,20 (вторая ступень диссоциации): pH от 6,2 до 8,2; фосфатно-солевой буфер.
Трис, pKa 8,07 при 25 °C: молекулярная биология, pH от 7 до 9; его pKa падает примерно на 0,03 на °C, поэтому трис-буфер, приготовленный при комнатной температуре, в холодной комнате примерно на 0,6 единицы щелочнее.
Аммонийный/аммиачный, pKa 9,25: pH от 8,3 до 10,3.

Выбирайте буфер с pKa в пределах 1 от нужного pH, в концентрации, дающей достаточную ёмкость для кислоты или основания, которые образуются в эксперименте, и не мешающий ему (фосфат осаждает кальций; трис реагирует с альдегидами).

Как пользоваться симуляцией

Симулятор буферов ставит рядом буфер и такой же объём воды. Каждое нажатие кнопки добавляет в оба одинаковое количество 1 М HCl или NaOH. Жидкости окрашены как универсальным индикатором, молекулы буфера меняют цвет с синего (кислотная форма) на жёлтый (основная форма), а красные или фиолетовые точки показывают свободные H₃O⁺ или OH⁻, одна на 0,1 мМ. Попробуйте:

Добавляйте кислоту по миллилитру и смотрите, как pH буфера едва ползёт, а pH воды обрушивается; затем продолжайте, пока основная форма буфера не кончится и его pH тоже не упадёт.
Снизьте концентрацию до 10 мМ: буфер сдаётся после десятой доли кислоты.
Начните с отношения 100 (логарифм отношения 2): буфер хорошо сопротивляется кислоте, но почти не сопротивляется основанию, потому что он уже почти весь в основной форме.
Сравните оценку по Хендерсону — Хассельбаху с точным pH, когда буфер близок к исчерпанию.

Что предполагает модель

Концентрации, а не активности. В реальных растворах ионы взаимодействуют, поэтому их эффективные концентрации (активности) ниже, на 10–25% при ионной силе 0,1 М. Измеренные pKa сдвигаются с ионной силой; у фосфата в типичных буферах он падает примерно до 6,8.
Одна кислотно-основная пара на буфер. Фосфат рассматривается только как H₂PO₄⁻/HPO₄²⁻, бикарбонат — только как CO₂/HCO₃⁻; их другие ступени диссоциации (pKa 2,15 и 12,35 у фосфата, 10,3 у бикарбоната) не учитываются.
Закрытый стакан при 25 °C, Kw = 10⁻¹⁴. У бикарбоната CO₂ не уходит в воздух.
Точный протонный баланс. pH находится из C_T[H⁺] ÷ ([H⁺] + Ka) + [H⁺] − Kw ÷ [H⁺] = (добавленные протоны) ÷ V, что верно при любом pH, в том числе при исчерпанном буфере.
Добавки смешиваются мгновенно и прибавляют свой объём; начальный объём 100 мл, кислота и основание 1 М.

Крайние случаи

Исчерпанный буфер: когда одной формы не осталось, уравнение Хендерсона — Хассельбаха даёт логарифм нуля или отрицательного числа и не определено; точное решение продолжается и показывает, что pH следует за избытком сильной кислоты или основания.
Очень разбавленные буферы (несколько мМ) около pH 7: собственные H⁺ и OH⁻ воды уже не пренебрежимы, и простое уравнение отходит от точного значения.
pH далеко от pKa: при отношении 100 или 1/100 у буфера мало ёмкости в одном направлении, и уравнение Хендерсона — Хассельбаха менее точно.
Чистая вода меняет pH примерно на 5 единиц от миллимолярной добавки, поэтому небуферные растворы непригодны для биохимии.

Где модель перестаёт быть верной

Высокая ионная сила. Выше примерно 0,1 М нужны поправки на активность (Дебая — Хюккеля, Дэвиса), и концентрированные буферы могут отличаться от этой модели на несколько десятых единицы pH.
Температура. pKa меняются с температурой, у триса примерно на −0,03 на °C, у фосфата гораздо меньше; модель использует значения при 25 °C.
Открытые системы. Бикарбонат в контакте с воздухом обменивается CO₂: кровь сохраняет pH, выдыхая CO₂, — гораздо более сильный эффект, чем показывает закрытый стакан.
Многоосновные и смешанные системы. Цитрат, фосфат во всём диапазоне и биологические жидкости со многими буферами требуют всех pKa; сами белки буферируют своими боковыми цепями.
Настоящие pH-метры измеряют активность, а не концентрацию, и требуют калибровки; число на приборе может отличаться от рассчитанного pH на 0,05–0,1, даже когда всё сделано правильно.

Калькуляторы

Приготовьте буфер с нужным pH в Калькулятор буферов, рассчитайте pH растворов кислот и оснований в Калькулятор pH и посмотрите полное титрование, где буферная область — пологий участок кривой, в Симулятор кривой титрования. Как рассчитать pH разбирает сильные и слабые кислоты вручную.

Как работают буферы: уравнение Хендерсона — Хассельбаха и буферная ёмкость