İki faz
Her kromatografi türünde yerinde kalan bir durgun faz (kâğıdın selülozu, bir İTK plağının silika jeli, bir kolondaki dolgu) ve onun yanından akan bir hareketli faz (bir çözücü ya da gaz kromatografisinde bir gaz) vardır. Karışımdaki her bileşik sürekli ikisi arasında gidip gelir: hareketli fazda çözünmüşken ilerler, durgun faza tutunmuşken bekler. Zamanının daha çoğunu tutunmuş geçiren bir bileşik daha yavaş ilerler; yani ne kadar güçlü tutundukları bakımından farklı olan bileşikler birbirinden ayrılır.
Tutunma süresinin ilerleme süresine oranı alıkonma faktörü k’dir. k = 1 olan bir bileşik zamanının yarısını ilerleyerek geçirir ve çözücünün yarı hızıyla gider.
Polarlık
Silika ve selüloz polardır; hidrojen bağı kuran OH gruplarıyla kaplıdır. Polar bileşikler (şekerler, amino asitler, klorofil b) onlara yapışır; apolar olanlar (karoten, yağlar) neredeyse hiç yapışmaz. Çözücü aynı yerler için yarışır: daha polar bir çözücü polar bileşikleri yerinden alır ve daha uzağa taşır. Yani bir silika plağında hekzan yalnızca apolar bileşikleri, etil asetat orta polarlıktakileri, etanol ya da su da çözünen hemen her şeyi taşır. Uzun hidrokarbon zincirleriyle kaplı ters fazlı kolonlar bunu tersine çevirir: orada apolar bileşikler tutunur.
Rf değerleri
Kâğıtta ya da bir İTK plağında çözücü aşağıdan yukarı tırmanır ve yürütme, çözücü tepeye ulaşmadan durdurulur. Her leke, çözücünün mesafesinin sabit bir kesri kadar yol almıştır:
Rf = lekenin aldığı yol ÷ çözücü cephesinin aldığı yol = 1 ÷ (1 + k)
İki mesafe de örneğin konduğu temel çizgiden ölçülür. Rf 0 ile 1 arasındadır ve belirli bir plak, çözücü ve sıcaklıkta her bileşiğin Rf’si her seferinde aşağı yukarı aynıdır; yani bilinmeyen bir leke, yanında yürütülen bir standartla eşleştirilebilir.
Çözümlü bir örnek
Bir ıspanak özütü, 9’a 1 hekzan ve asetonda silika plakta yürütülüyor. Cephe temel çizginin 6,0 cm üstünde duruyor.
- 5,7 cm’de turuncu bir leke: Rf = 5,7 ÷ 6,0 = 0,95; en az polar pigment olan β-karoten.
- 2,7 cm’de mavi-yeşil bir leke: Rf = 0,45; klorofil a; k = 1 ÷ 0,45 − 1 = 1,2.
- 2,1 cm’de sarı-yeşil bir leke: Rf = 0,35; fazladan bir C=O grubu olan ve daha polar olan klorofil b.
- 1,5 cm’de sarı bir leke: Rf = 0,25; silikayı kavrayan OH gruplarıyla ksantofiller.
Sıra polarlığı izler; en az polar en tepededir. Bu pigmentler için yayımlanan değerler plağa, çözücü karışımına ve plağın ne kadar kuru olduğuna göre laboratuvardan laboratuvara değişir; standartların yan yana yürütülmesinin nedeni budur.
Kolonlar ve kromatogramlar
Kolon kromatografisinde (ve HPLC ile gaz kromatografisinde) hareketli faz dolgulu bir tüpten akar ve bileşikler uçtan birbiri ardına çıkıp her biri için bir tepe çizen bir dedektöre girer. Çözücünün kendisinin geçmesi ölü süre t₀ kadar sürer; alıkonma faktörü k olan bir bileşik ise
tR = t₀ (1 + k) kadar sürer
Moleküller dolgunun içinden farklı yollar izlediği ve yayındığı için tepeler ilerledikçe genişler. Bir kolonun verimi teorik tabaka sayısı N’dir: tepe genişliği (standart sapma) σ = tR ÷ √N’dir. İyi bir HPLC kolonunun 10.000 ya da daha fazla tabakası olur; elle doldurulmuş bir yerçekimi kolonunun belki birkaç yüz.
Örneği t₀ = 2,7 dk ve N = 2.000 olan bir kolonda sürdürelim: klorofil a (k = 1,22) 2,7 × 2,22 = 6,0 dakikada σ = 6,0 ÷ √2000 = 0,13 dk ile çıkar; klorofil b (k = 1,86) 7,7 dakikada σ = 0,17 dk ile çıkar.
Ayırma gücü
İki komşunun ayrılıp ayrılmadığı, aralarındaki boşluğa da genişliklerine de bağlıdır:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂); taban genişliği w = 4σ
İki klorofil için Rs = 2 × 1,72 ÷ (0,54 + 0,69) = 2,8: temiz biçimde ayrılmış. Rs = 1,5 temel çizgiye kadar ayırma verir; 1’de tepeler yaklaşık %2 örtüşür; bunun altında birleşirler. Purnell denklemi onu iyileştirmenin üç yolunu gösterir:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
Burada α = k₂ ÷ k₁’dir. Daha iyi bir kolon (büyük N) yalnızca karekök kadar yardım eder; iki bileşiğin ne kadar farklı tutunduğunu, yani α’yı değiştirmek için çözücüyü değiştirmek genellikle çok daha fazla yardım eder.
Simülasyonu kullanmak
Kromatografi simülatöründe denenecek şeyler:
- Yaprak pigmentlerini hekzan ve asetonda, sonra saf hekzanda yürüt: hekzanda yalnızca karoten ilerler; klorofiller temel çizginin yakınında kalır.
- Suda siyah mürekkep: boyalar ayrılır; hekzanda ise çözünmedikleri için hiç ilerlemezler.
- Bütanol, asetik asit ve suda amino asitler: ninhidrin boyasını işaretleyene kadar hiçbir şey görünmez; sonra lösin ve fenilalanin neredeyse örtüşür.
- Lekeyi 6 mm genişliğinde yap: her leke büyür ve komşular birleşir.
- Kolonda N’yi 2.000’den 200’e düşür ve tepelerin genişleyip ayırma gücünün düştüğünü izle.
Modelin varsayımları
- Tek bir polarlık ölçeği. Her bileşiğin, Rf’si bir referans çözücüde yayımlanmış bir değere uyacak şekilde seçilmiş tek bir polarlık sayısı vardır ve her çözücünün 0 ile 1 arasında bir değeri vardır; k = e8(p − s). Gerçek alıkonma tek bir sayıya değil; hidrojen bağına, asitliğe, boyuta ve biçime bağlıdır.
- Anahtar gibi çözünürlük. Mürekkep boyaları yalnızca polar çözücülerde, yaprak pigmentleri su dışında her şeyde, amino asitler yalnızca oldukça polar çözücülerde çözünür; aksi halde Rf = 0’dır.
- Kâğıt, İTK ve kolon için aynı durgun faz.
- Çözücüye bağlı bir hızda, zamanın kareköküyle yükselen bir cephe (Lucas–Washburn yasası).
- Gauss biçimli lekeler ve tepeler; yayınımla mesafeyle birlikte genişler; miktarlar küçüktür, yani aşırı yükleme yoktur.
- 4,6 mm çapında, %65’i boş olan 25 cm’lik bir kolon; yani t₀ = 2,7 mL ÷ debi.
Sınır durumları
- 0’a ya da 1’e yakın Rf: bileşikler temel çizgide ya da cephede yığılır ve birbirinden ayırt edilemez. Çözücüyü seçerek Rf değerlerini yaklaşık 0,2 ile 0,8 arasında tutmayı hedefle.
- Temel çizginin üstündeki çözücü: lekeler yürümek yerine dipteki çözücüye yıkanır.
- Renksiz bileşikler görülebilmek için bir boya (amino asitler için ninhidrin, iyot buharı, floresan bir plakta UV ışık) ister.
- Aynı Rf iki bileşiğin aynı olduğunu kanıtlamaz; onları ikinci bir çözücüde ya da yan yana ve karıştırılmış olarak (birlikte lekeleme) yürüt.
Modelin doğru olmaktan çıktığı yerler
- Kuyruklanma ve aşırı yükleme. Çok fazla örnek ya da silikada asidik ve bazik bileşikler, düzgün daireler yerine çizgiler ve kuyruklu yıldız biçimli lekeler oluşturur.
- Karışık çözücüler kendi kendini ayırır. Bir karışımın daha polar kısmı plak tarafından geride tutulur; yani çözücü bileşimi plak boyunca değişir ve kuru, doygun olmayan bir tank çözücünün tırmanırken plaktan buharlaşmasına izin verir; ikisi de Rf değerlerini kaydırır.
- Sıcaklık ve nem Rf’yi değiştirir ve havadan su almış silika daha az etkin hale gelir.
- Gradyan elüsyon, yani bir kolon yürütmesi boyunca çözücünün kademeli olarak güçlendirilmesi, HPLC’nin çoğunun yapılma biçimidir; bu model çözücüyü sabit tutar.
- Diğer mekanizmalar. İyon değişimi, boyut dışlama ve afinite kromatografisi polarlığa göre değil; yüke, boyuta ve özgül bağlanmaya göre ayırır.
İlgili araçlar
Jel elektroforezi simülatörü DNA’yı boyutuna göre ayırır; bu da bir karışımı parçalara ayırmanın başka bir yoludur. Spektrofotometre ve Beer-Lambert yasası simülatörü bir dedektörün bir bileşiğin ne kadarının çıktığını nasıl ölçtüğünü gösterir; 3B molekül görüntüleyici de moleküllerin tutunmasına yol açan polar grupları gösterir.