Beer-Lambert yasası: absorbans, spektrofotometreler ve standart eğriler

Bir spektrofotometre nasıl çalışır

Bir lamba beyaz ışık verir (görünür bölge için tungsten, morötesi için döteryum lambası). Bir monokromatör, yani yarıklı bir prizma ya da kırınım ağı, dar bir dalga boyu bandı seçer. Bu ışık bir küvetteki örnekten geçer ve bir dedektöre düşer. Önce I₀’ı vermek üzere bir kör, yani yalnızca çözücü içeren küvet ölçülür; sonra örnek I’yi verir. Birini diğerine bölmek lambanın parlaklığını, küvetin yansımalarını ve çözücünün kendi soğurmasını sadeleştirir.

Geçirgenlik ve absorbans

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

Geçirgenlik, ışığın geçen payıdır. Absorbans onun negatif logaritmasıdır; bu, ışığın bir örnekte her milimetrede aynı kesir kadar sönme biçimini, soğurucunun miktarıyla doğrusal olarak büyüyen bir sayıya çevirir:

• A = 0: ışığın tamamı geçer.
• A = 1: %10’u geçer.
• A = 2: %1. A = 3: %0,1.

Beer-Lambert yasası

A = ε l c

• ε, maddenin o dalga boyundaki soğurganlığıdır: ne kadar güçlü soğurduğu. M⁻¹ cm⁻¹ cinsinden molar soğurganlık ya da sönüm katsayısıdır.
• l, örnek boyunca ışık yolu uzunluğudur; standart bir küvette 1 cm.
• c derişimdir.

Derişimi ya da yolu iki katına çıkar ve absorbans iki katına çıkar. ε bilindiğinde yasa, ölçülen bir absorbansın doğrudan derişime çevrilmesini sağlar.

Çözümlü örnekler

1. Potasyum permanganatın 525 nm’de ε = 2.455 M⁻¹ cm⁻¹’dir. 1 cm’lik küvette 80 µM’lık bir çözelti: A = 2.455 × 1 × 0,000080 = 0,196; T = 10^−0,196 = %63,7.
2. Protein: sığır serum albümini 280 nm’de triptofanı ve tirozini sayesinde cm başına mg/mL başına 0,667 soğurur. 0,40 okuması 0,40 ÷ 0,667 = 0,60 mg/mL demektir.
3. DNA: 50 µg/mL’de çift iplikli DNA A₂₆₀ = 1,0 verir. 10’da 1 seyreltilmiş ve 0,25 okuyan bir örnek 0,25 × 50 × 10 = 125 µg/mL içerir. Saf DNA’nın A₂₆₀ ÷ A₂₈₀’i yaklaşık 1,8’dir; daha düşük bir oran içinde protein olduğunu düşündürür.

Soğurma tayfları

Absorbansı dalga boyuna karşı çizmek maddenin soğurma tayfını verir. Tepesinde, λ_maks’ta ölç: okuma en büyüktür, yani en duyarlıdır ve eğri orada düzdür, yani dalga boyundaki küçük hatalar en az önemlidir. Bir çözelti, soğurmadığı ışığın renginde görünür: permanganat yeşili (yaklaşık 525 nm) soğurur ve mor görünür; bakır sülfat kırmızıyı ve yakın kızılötesini (yaklaşık 800 nm) soğurur ve soluk mavi görünür.

Standart eğriler

ε çoğu zaman tam o örnek ve koşullar için bilinmez ya da aletin kontrol edilmesi gerekir. O zaman derişimi bilinen bir dizi standart ölçülür, absorbans derişime karşı çizilir ve bir A = m c + b doğrusu uydurulur. Bilinmeyenin derişimi c = (A − b) ÷ m’dir.

Örnek: 0, 25, 50 ve 100 µM’lık permanganat standartları 0,000; 0,061; 0,123 ve 0,245 okur. Uydurulan eğim µM başına 0,00245’tir ve kesişim sıfıra yakındır. 0,150 okuyan bir bilinmeyen 0,150 ÷ 0,00245 = 61 µM’dir. Cevaba yalnızca standartların aralığı içinde ve yalnızca R² 1’e yakınsa güven.

Simülasyonu kullanmak

Spektrofotometre ve Beer-Lambert yasası simülatöründe denenecek şeyler:

• Permanganatı tepesinde ölç: derişimi iki katına çıkar ve absorbans iki katına çıkarken geçirgenlik %64’ten %41’e düşer.
• Yol uzunluğunu yarıya indir: absorbans yarıya iner.
• Derişimi en üste çıkar: ölçülen absorbans Beer-Lambert doğrusunun altına düşer ve kaçak ışık nedeniyle 3’ün yakınında düzleşir. Kaçak ışık işaretini kaldır ve ikisi uyuşur.
• Permanganatın dar tepelerinde yarığı 20 nm’ye genişlet: tepe absorbansı düşer ve tayf yumuşar.
• Plastik küvette 260 nm’de DNA’yı seç: küvet morötesinin neredeyse tamamını soğurur ve okuma gürültüye dönüşür.
• Dört standart ekle, bilinmeyeni ölç ve cevabı gösterilen gerçek değerle karşılaştır.

Modelin varsayımları

• Bir dalga boyunda yayımlanmış değerlere ölçeklenmiş, düzgün tepelerden kurulu soğurma tayfları: 525 nm’de permanganat 2.455 M⁻¹ cm⁻¹, 810 nm’de bakır sülfat yaklaşık 12,5 M⁻¹ cm⁻¹, 280 nm’de albümin mg/mL başına 0,667, 260 nm’de DNA µg/mL başına 0,020. Diğer yerlerdeki biçimler yaklaşıktır.
• Üçgen bir yarık bandı: okuma, geçirgenliği ± yarık genişliği boyunca ortalar.
• Seçilen dalga boyunda soğurucudan geçmeden dedektöre ulaşan %0,1 kaçak ışık.
• Küvetler: kuvars 200 nm’den itibaren her yerde geçirir; polistiren yaklaşık 300 nm’nin altında geçirmez.
• Biraz dedektör gürültüsü; yani okumalar son basamakta salınır ve neredeyse hiç ışık geçmediğinde güvenilmez olur.
• Kör, küveti ve çözücüyü tam olarak sadeleştirir ve bilinmeyen, Sıfırla’dan sonra her çözelti için yeni bir rastgele derişimdir.

Sınır durumları

• Sıfır derişim, kör aynı küvet ve çözücü olduğu için gürültü dışında A = 0 okur.
• Hiçbir şeyin soğurmadığı dalga boyları her derişimde A ≈ 0 verir; bakır sülfat yeşilde neredeyse hiç soğurmaz.
• Çok yüksek absorbans, kaçak ışığın −log₁₀’una yakın bir tavana ulaşır: %0,1 için yaklaşık 3.
• Standartlar bir dalga boyunda, bilinmeyen başka bir dalga boyunda ölçülürse anlamsız bir cevap çıkar; simülasyon uyarır.

Modelin doğru olmaktan çıktığı yerler

• Derişik çözeltiler. Yaklaşık 10 mM’nin üstünde moleküller birbirinin soğurmasını etkileyecek kadar yakın durur ve kırılma indisi değişir; kusursuz bir aletle bile doğru eğrilir.
• Küvetteki kimya. Eşleşen boyalar, rengi pH’a bağlı asit ve bazlar ve seyreltmede ayrışan kompleksler ε’yi derişimle değiştirir.
• Saçılma. Bulanık örnekler, hücreler ve çökeltiler ışığı dedektörden uzağa saçar ve bu, olmayan bir absorbans olarak okunur; bakteri kültürünün OD600 okuması bunu bilerek ölçer.
• Floresans. Işığın bir kısmını yeniden yayan bir örnek onu dedektöre gönderip düşük okutabilir.
• Proteinler farklıdır. 0,667 değeri albümin içindir; diğer proteinlerin triptofan ve tirozin miktarları farklıdır ve mg/mL başına yarısı ya da iki katı kadar soğurabilirler.

Hesaplayıcılar

A = εlc’yi herhangi bir terimi için Beer-Lambert yasası hesaplayıcı ile çöz, kendi okumalarını Standart eğri hesaplayıcı ile uydur ve nükleik asit ve protein derişimlerini DNA derişimi hesaplayıcı ve Protein derişimi hesaplayıcı (A280) ile hesapla. Standart eğri nasıl hazırlanır ve A280’de protein derişimi nasıl ölçülür kılavuzları daha ileri gider.