বিয়ার-লামবার্ট সূত্র বুঝে নিন: শোষণ, সঞ্চালন, শোষণের বর্ণালি আর আদর্শ বাঁক

একটি স্পেকট্রোফোটোমিটার কীভাবে কাজ করে

একটি বাতি সাদা আলো দেয় (দৃশ্যের জন্য একটি টাংস্টেন বাতি, অতিবেগুনির জন্য একটি ডয়টেরিয়াম বাতি)। একটি মনোক্রোমেটর, অর্থাৎ একটি চিরওয়ালা প্রিজম কিংবা অপবর্তন গ্রেটিং, তরঙ্গদৈর্ঘ্যের একটি সরু পটি বেছে নেয়। ওই আলো একটি কিউভেটে নমুনাটির ভেতর দিয়ে পার হয়ে একটি সন্ধানীর ওপরে পড়ে। আগে একটি ব্ল্যাংক, অর্থাৎ কেবল দ্রাবকওয়ালা কিউভেটটি মাপা হয় I₀ পেতে; তারপর নমুনাটি দেয় I। একটিকে অন্যটি দিয়ে ভাগ করলে বাতির উজ্জ্বলতা, কিউভেটের প্রতিফলন আর দ্রাবকের নিজের শোষণ কেটে যায়।

সঞ্চালন আর শোষণ

T = I ÷ I₀, A = −log₁₀ T

সঞ্চালন হলো আলোর যে ভাগটি পার হয়ে যায়। শোষণ হলো তার ঋণাত্মক লগারিদম, যা একটি নমুনায় আলো কীভাবে মিলিয়ে যায়, অর্থাৎ প্রতিটি মিলিমিটারে একই ভগ্নাংশে, তা এমন একটি সংখ্যায় বদলে দেয় যা শোষকের পরিমাণের সঙ্গে একটি সরলরেখায় বাড়ে:

A = 0: সব আলোই পার হয়ে যায়।
A = 1: 10% পার হয়।
A = 2: 1%। A = 3: 0.1%।

বিয়ার-লামবার্ট সূত্র

A = ε l c

ε হলো ওই তরঙ্গদৈর্ঘ্যে পদার্থটির শোষকতা: তা কত জোরালোভাবে শোষণ করে। M⁻¹ cm⁻¹-এ তা মোলার শোষকতা, কিংবা নির্বাপণ গুণাঙ্ক।
l হলো নমুনার ভেতর দিয়ে পথের দৈর্ঘ্য, একটি চলতি কিউভেটে 1 cm।
c হলো ঘনমাত্রা।

ঘনমাত্রা কিংবা পথ দ্বিগুণ করলে শোষণ দ্বিগুণ হয়। ε জানা থাকলে সূত্রটি একটি মাপা শোষণকে সোজা একটি ঘনমাত্রায় বদলে নিতে দেয়।

কষে দেখানো উদাহরণ

পটাশিয়াম পারম্যাঙ্গানেটের 525 nm-এ ε = 2,455 M⁻¹ cm⁻¹। একটি 1 cm কিউভেটে একটি 80 µM দ্রবণ: A = 2,455 × 1 × 0.000080 = 0.196, T = 10^−0.196 = 63.7%।
প্রোটিন: গরুর সিরাম অ্যালবুমিন 280 nm-এ তার ট্রিপ্টোফ্যান আর টাইরোসিন থেকে প্রতি cm-এ প্রতি mg/mL-এ 0.667 শোষণ করে। 0.40-র একটি পাঠ মানে 0.40 ÷ 0.667 = 0.60 mg/mL।
DNA: 50 µg/mL-এ দুই-সূত্রক DNA দেয় A₂₆₀ = 1.0। 10-এ 1 লঘু করা একটি নমুনা 0.25 পড়লে তাতে আছে 0.25 × 50 × 10 = 125 µg/mL। শুদ্ধ DNA-র A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ প্রায় 1.8; তার চেয়ে কম অনুপাত তাতে প্রোটিন থাকার ইশারা দেয়।

শোষণের বর্ণালি

তরঙ্গদৈর্ঘ্যের বিপরীতে শোষণ আঁকলে পদার্থটির শোষণের বর্ণালি মেলে। তার চূড়ায়, λ_max-এ মাপুন: পাঠটি সবচেয়ে বড়, তাই সবচেয়ে সংবেদী, আর ওখানে বাঁকটি সমান, তাই তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ছোট ভুলে সবচেয়ে কম এসে যায়। একটি দ্রবণ সে যে আলো শোষণ করে না তারই রঙের দেখায়: পারম্যাঙ্গানেট সবুজ (প্রায় 525 nm) শোষণ করে আর বেগুনি দেখায়; কপার সালফেট লাল আর নিকট অবলোহিত (প্রায় 800 nm) শোষণ করে আর হালকা নীল দেখায়।

আদর্শ বাঁক

প্রায়ই নির্দিষ্ট নমুনা আর অবস্থায় ε জানা থাকে না, কিংবা যন্ত্রটি পরখ করা দরকার হয়। তখন জানা ঘনমাত্রার আদর্শের একটি ধারা মাপা হয়, ঘনমাত্রার বিপরীতে শোষণ আঁকা হয় আর একটি সরলরেখা A = m c + b বসানো হয়। একটি অজানার ঘনমাত্রা c = (A − b) ÷ m।

উদাহরণ: 0, 25, 50 আর 100 µM-র পারম্যাঙ্গানেটের আদর্শ পড়ে 0.000, 0.061, 0.123 আর 0.245। বসানো ঢালটি প্রতি µM-এ 0.00245, আর ছেদ শূন্যের কাছে। 0.150 পড়া একটি অজানা হলো 0.150 ÷ 0.00245 = 61 µM। উত্তরটিতে ভরসা করুন কেবল আদর্শগুলোর পরিসরের ভেতরে, আর কেবল যদি R² 1-র কাছে হয়।

সিমুলেশনটি ব্যবহার করা

স্পেকট্রোফোটোমিটার আর বিয়ার-লামবার্ট সূত্রের সিমুলেটর-এ দেখে নেওয়ার মতো কিছু:

পারম্যাঙ্গানেট তার চূড়ায়: ঘনমাত্রা দ্বিগুণ করুন আর শোষণ দ্বিগুণ হয়, আর সঞ্চালন 64% থেকে 41%-এ নামে।
পথের দৈর্ঘ্য অর্ধেক করুন: শোষণ অর্ধেক হয়ে যায়।
ঘনমাত্রা একেবারে ওপরে ঠেলে দিন: মাপা শোষণ বিয়ার-লামবার্টের রেখার নিচে নেমে যায়, আর বিপথগামী আলোর কারণে 3-র কাছে চ্যাপ্টা হয়ে পড়ে। বিপথগামী আলোর টিক তুলে দিলে দুটি মিলে যায়।
পারম্যাঙ্গানেটের সরু চূড়ায় চির 20 nm-এ চওড়া করুন: চূড়ার শোষণ নেমে যায় আর বর্ণালি মসৃণ হয়ে যায়।
একটি প্লাস্টিকের কিউভেটে 260 nm-এ DNA বেছে নিন: কিউভেটটি প্রায় সব অতিবেগুনিই শোষণ করে আর পাঠটি গোলমাল হয়ে যায়।
চারটি আদর্শ জুড়ুন, অজানাটি মাপুন, আর উত্তরটি দেখানো আসল মানের সঙ্গে মিলিয়ে দেখুন।

আদলটি যা ধরে নেয়

মসৃণ চূড়া থেকে গড়া শোষণের বর্ণালি, যা একটি তরঙ্গদৈর্ঘ্যে ছাপা মানে মাপে বসানো: 525 nm-এ পারম্যাঙ্গানেট 2,455 M⁻¹ cm⁻¹, 810 nm-এ কপার সালফেট প্রায় 12.5 M⁻¹ cm⁻¹, 280 nm-এ অ্যালবুমিন প্রতি mg/mL-এ 0.667, 260 nm-এ DNA প্রতি µg/mL-এ 0.020। অন্য জায়গায় আকারগুলো আন্দাজি।
একটি ত্রিভুজাকার চিরের পটি: পাঠটি ± চিরের চওড়া জুড়ে সঞ্চালনের গড় নেয়।
0.1% বিপথগামী আলো, যা বেছে নেওয়া তরঙ্গদৈর্ঘ্যে শোষকের ভেতর দিয়ে না গিয়েই সন্ধানীতে পৌঁছায়।
কিউভেট: কোয়ার্টজ 200 nm থেকে সবখানেই আলো পার হতে দেয়; পলিস্টাইরিন প্রায় 300 nm-র নিচে আর পার হতে দেয় না।
একটু সন্ধানীর গোলমাল, তাই পাঠ শেষ অঙ্কে দোলে আর প্রায় কোনো আলোই পার না হলে তা ভরসার অযোগ্য হয়ে যায়।
ব্ল্যাংকটি কিউভেট আর দ্রাবক অবিকল কেটে দেয়, আর Reset-র পরে প্রতিটি দ্রবণে অজানাটি একটি নতুন এলোমেলো ঘনমাত্রা।

কিনারার বেলা

শূন্য ঘনমাত্রা গোলমাল ছাড়া A = 0 পড়ে, কারণ ব্ল্যাংকটি একই কিউভেট আর দ্রাবকই।
যে তরঙ্গদৈর্ঘ্যে কিছুই শোষণ করে না সেখানে যেকোনো ঘনমাত্রাতেই A ≈ 0; কপার সালফেট সবুজে প্রায় শোষণই করে না।
খুব উঁচু শোষণ বিপথগামী আলোর −log₁₀-র কাছে একটি ছাদে পৌঁছায়: 0.1%-এ প্রায় 3।
এক তরঙ্গদৈর্ঘ্যে আদর্শ, অন্যটিতে অজানা অর্থহীন একটি উত্তর দেয়; সিমুলেশনটি সতর্ক করে।

আদলটি কোথায় আর ঠিক থাকে না

ঘন দ্রবণ। প্রায় 10 mM-র ওপরে অণু এতটা কাছে বসে যে একে অন্যের শোষণে এসে যায়, আর প্রতিসরাঙ্ক বদলায়; একটি নিখুঁত যন্ত্রেও রেখাটি বেঁকে যায়।
কিউভেটের ভেতরে রসায়ন। যে রঞ্জক জোড়া বাঁধে, যে অ্যাসিড ও ক্ষারের রং pH-র ওপরে নির্ভর করে, আর যে যৌগ লঘু করায় ভেঙে যায় — সবই ঘনমাত্রার সঙ্গে ε বদলে দেয়।
বিক্ষেপণ। ঘোলা নমুনা, কোষ আর অবক্ষেপ আলো সন্ধানী থেকে দূরে ছড়িয়ে দেয়, যা এমন শোষণ হিসেবে পড়া হয় যা আসলে নেই; একটি ব্যাকটেরিয়ার চাষের একটি OD600 পাঠ ইচ্ছে করেই তা মাপে।
প্রতিপ্রভা। যে নমুনা আলোর কিছুটা আবার ছেড়ে দেয় তা সন্ধানীতে পাঠিয়ে দিতে পারে আর কম পড়তে পারে।
প্রোটিনে প্রোটিনে তফাত। 0.667 সংখ্যাটি অ্যালবুমিনের; অন্য প্রোটিনে ট্রিপ্টোফ্যান আর টাইরোসিনের পরিমাণ আলাদা আর সেগুলো প্রতি mg/mL-এ তার অর্ধেক কিংবা দ্বিগুণও শোষণ করতে পারে।

হিসাব

বিয়ার-লামবার্ট সূত্রের হিসাব দিয়ে A = εlc তার যেকোনো পদের জন্য কষে দিন, আদর্শ বাঁকের হিসাব দিয়ে নিজের পাঠ বসিয়ে নিন, আর DNA-র ঘনমাত্রার হিসাব ও প্রোটিনের ঘনমাত্রার হিসাব (A280) দিয়ে নিউক্লিক অ্যাসিড আর প্রোটিনের ঘনমাত্রা বের করুন। একটি আদর্শ বাঁক কীভাবে বানাবেন আর A280-তে প্রোটিনের ঘনমাত্রা কীভাবে মাপবেন পথনির্দেশ আরও এগিয়ে যায়।

বিয়ার-লামবার্ট সূত্র বুঝে নিন: শোষণ, স্পেকট্রোফোটোমিটার আর আদর্শ বাঁক