দুটি দশা
প্রতিটি ধরনের ক্রোমাটোগ্রাফিতেই একটি স্থির দশা থাকে, যা জায়গাতেই থেকে যায় (কাগজের সেলুলোজ, একটি TLC পাতের সিলিকা জেল, একটি কলামের ভরাট), আর একটি চলমান দশা, যা তার পাশ দিয়ে বয়ে যায় (একটি দ্রাবক, কিংবা গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফিতে একটি গ্যাস)। মিশেলের প্রতিটি যৌগই একটানা দুটির মাঝে চলাচল করে: চলমান দশায় গুলে থাকতে তা চলে, স্থির দশায় সেঁটে থাকতে তা অপেক্ষা করে। যে যৌগ তার বেশি সময় সেঁটে কাটায় তা আরও ধীরে চলে, তাই যে যৌগগুলো কত জোরে সেঁটে থাকে তাতে আলাদা সেগুলো আলাদা হয়ে যায়।
সেঁটে থাকা সময়ের সঙ্গে চলা সময়ের অনুপাতটিই ধরে রাখার গুণক k। k = 1-র একটি যৌগ তার অর্ধেক সময় চলে আর দ্রাবকের অর্ধেক বেগে চলে।
পোলারিটি
সিলিকা আর সেলুলোজ পোলার, আর হাইড্রোজেন বন্ধন বাঁধা OH গুচ্ছে ঢাকা। পোলার যৌগ (শর্করা, অ্যামিনো অ্যাসিড, ক্লোরোফিল b) সেগুলোকে আঁকড়ে ধরে; অপোলারগুলো (ক্যারোটিন, চর্বি) প্রায় ধরেই না। দ্রাবকটি একই জায়গাগুলোর জন্য লড়ে: একটি বেশি পোলার দ্রাবক পোলার যৌগগুলো আলগা করে দেয় আর আরও দূরে বইয়ে নেয়। তাই একটি সিলিকার পাতে হেক্সেন কেবল অপোলার যৌগই চালায়, ইথাইল অ্যাসিটেট মাঝারি পোলারগুলো চালায়, আর ইথানল কিংবা পানি যা-ই গুলে যায় প্রায় তার সবই চালায়। লম্বা হাইড্রোকার্বনের শিকলে ঢাকা উল্টো-দশার কলাম এটি উল্টে দেয়: ওখানে অপোলার যৌগই সেঁটে থাকে।
Rf মান
কাগজে কিংবা একটি TLC পাতে দ্রাবক তলা থেকে হেঁটে ওঠে আর তা ওপরে পৌঁছানোর আগেই চলাটি থামিয়ে দেওয়া হয়। প্রতিটি দাগই দ্রাবকের দূরত্বের একটি বাঁধা ভগ্নাংশই চলেছে:
Rf = দাগটি যতদূর চলেছে ÷ দ্রাবকের সামনের ধার যতদূর চলেছে = 1 ÷ (1 + k)
দুটি দূরত্বই মাপা হয় নমুনাটি যে গোড়ার রেখায় বসানো হয়েছিল তা থেকে। Rf থাকে 0 আর 1-র মধ্যে, আর একটি দেওয়া পাত, দ্রাবক আর তাপমাত্রায় প্রতিটি যৌগেরই প্রতিবারই প্রায় একই Rf, তাই একটি অজানা দাগ তার পাশে চালানো একটি আদর্শের সঙ্গে মিলিয়ে নেওয়া যায়।
একটি কষে দেখানো উদাহরণ
পালং শাকের একটি নির্যাস 9-র সঙ্গে 1 হেক্সেন আর অ্যাসিটোনে একটি সিলিকার পাতে চালানো হয়। সামনের ধারটি গোড়ার রেখার 6.0 cm ওপরে থামে।
- 5.7 cm-এ একটি কমলা দাগ: Rf = 5.7 ÷ 6.0 = 0.95, অর্থাৎ β-ক্যারোটিন, সবচেয়ে কম পোলার রঞ্জক।
- 2.7 cm-এ একটি নীল-সবুজ দাগ: Rf = 0.45, ক্লোরোফিল a; k = 1 ÷ 0.45 − 1 = 1.2।
- 2.1 cm-এ একটি হলুদ-সবুজ দাগ: Rf = 0.35, ক্লোরোফিল b, যার একটি বাড়তি C=O গুচ্ছ আছে আর তা বেশি পোলার।
- 1.5 cm-এ একটি হলুদ দাগ: Rf = 0.25, অর্থাৎ জ্যান্থোফিল, যাদের OH গুচ্ছ সিলিকা আঁকড়ে ধরে।
ক্রমটি পোলারিটিই মেনে চলে, সবচেয়ে কম পোলার সবচেয়ে ওপরে। এই রঞ্জকগুলোর ছাপা মান পাত, দ্রাবকের মিশেল আর পাতটি কতটা শুকনো তার সঙ্গে গবেষণাগারে গবেষণাগারে হেরফের করে, আর তাই পাশে আদর্শও চালানো হয়।
কলাম আর ক্রোমাটোগ্রাম
কলাম ক্রোমাটোগ্রাফিতে (আর HPLC ও গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফিতে) চলমান দশা একটি ভরা নলের ভেতর দিয়ে বয় আর যৌগগুলো প্রান্তে একের পর এক বেরিয়ে আসে, একটি সন্ধানীতে, যা প্রত্যেকটির জন্য একটি চূড়া আঁকে। দ্রাবক নিজেই পার হতে নেয় মরা সময় t₀; k ধরে রাখার গুণকের একটি যৌগ নেয়
tR = t₀ (1 + k)
চূড়া চলার সঙ্গে ছড়িয়ে পড়ে, কারণ অণু ভরাটের ভেতর দিয়ে আলাদা আলাদা পথ নেয় আর ব্যাপিত হয়। একটি কলামের দক্ষতা হলো তার তাত্ত্বিক পাতের সংখ্যা N: চূড়ার চওড়া (পরিমিত ব্যবধান) হলো σ = tR ÷ √N। একটি ভালো HPLC কলামে 10,000 বা তার বেশি পাত থাকে; হাতে ভরা একটি অভিকর্ষের কলামে হয়তো কয়েকশো।
t₀ = 2.7 মিনিট আর N = 2,000-র একটি কলামে উদাহরণটি চালিয়ে গেলে: ক্লোরোফিল a (k = 1.22) বেরোয় 2.7 × 2.22 = 6.0 মিনিটে, σ = 6.0 ÷ √2000 = 0.13 মিনিট; ক্লোরোফিল b (k = 1.86) বেরোয় 7.7 মিনিটে, σ = 0.17 মিনিট।
বিভেদন
দুটি পাশের চূড়া আলাদা হয় কি না তা তাদের মাঝের ফাঁক আর তাদের চওড়া — দুটির ওপরেই নির্ভর করে:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂), যেখানে তলার চওড়া w = 4σ
দুটি ক্লোরোফিলে Rs = 2 × 1.72 ÷ (0.54 + 0.69) = 2.8: পরিষ্কারভাবে আলাদা। Rs = 1.5 গোড়ার রেখা পর্যন্ত আলাদা করে দেয়; 1-তে চূড়াগুলো প্রায় 2% একটির ওপরে আরেকটি পড়ে; তার নিচে সেগুলো মিশে যায়। পার্নেলের সমীকরণ তা ভালো করার তিনটি পথ দেখায়:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
যেখানে α = k₂ ÷ k₁। একটি ভালো কলাম (বড় N) সাহায্য করে কেবল বর্গমূল হিসেবে; দুটি যৌগ কত আলাদাভাবে সেঁটে থাকে, অর্থাৎ α বদলাতে দ্রাবক বদলে দিলে তা সাধারণত অনেক বেশি সাহায্য করে।
সিমুলেশনটি ব্যবহার করা
ক্রোমাটোগ্রাফির সিমুলেটর-এ দেখে নেওয়ার মতো কিছু:
- হেক্সেন আর অ্যাসিটোনে পাতার রঞ্জক, তারপর শুদ্ধ হেক্সেনে: হেক্সেনে কেবল ক্যারোটিনই চলে; ক্লোরোফিলগুলো গোড়ার রেখার কাছেই থেকে যায়।
- পানিতে কালো কালি: রঞ্জকগুলো আলাদা হয়ে যায়; হেক্সেনে সেগুলো একেবারেই নড়ে না, কারণ সেগুলো গুলেই যায় না।
- বিউটানল, অ্যাসেটিক অ্যাসিড আর পানিতে অ্যামিনো অ্যাসিড: আপনি নিনহাইড্রিনের রং টিক না করা পর্যন্ত কিছুই দেখা যায় না, তারপর লিউসিন আর ফিনাইলঅ্যালানিন প্রায় একটির ওপরে আরেকটি পড়ে যায়।
- দাগটি 6 mm চওড়া করুন: প্রতিটি দাগই বেড়ে যায় আর পাশেরগুলো মিশে যায়।
- কলামে N 2,000 থেকে 200-তে নামিয়ে চূড়াগুলো চওড়া হতে আর বিভেদন নামতে দেখুন।
আদলটি যা ধরে নেয়
- একটিই পোলারিটির মাপকাঠি। প্রতিটি যৌগেরই একটি পোলারিটির সংখ্যা, যা এমনভাবে বেছে নেওয়া যাতে একটি সূত্র দ্রাবকে তার Rf একটি ছাপা মানের সঙ্গে মেলে, আর প্রতিটি দ্রাবকের 0 থেকে 1 মাপকাঠিতে একটি; k = e8(p − s)। আসল ধরে রাখা হাইড্রোজেন বন্ধন, অম্লতা, মাপ আর আকারের ওপর নির্ভর করে, একটি সংখ্যার ওপরে নয়।
- দ্রবণীয়তা একটি স্বিচ হিসেবে। কালির রঞ্জক কেবল পোলার দ্রাবকে গোলে, পাতার রঞ্জক পানি ছাড়া যেকোনোটিতে, অ্যামিনো অ্যাসিড কেবল বেশ পোলার দ্রাবকে; নইলে Rf = 0।
- কাগজ, TLC আর কলামে একই স্থির দশা।
- একটি সামনের ধার, যা সময়ের বর্গমূল হিসেবে ওঠে (লুকাস–ওয়াশবার্নের সূত্র), আর তার বেগ দ্রাবকের ওপরে নির্ভর করে।
- গাউসীয় দাগ আর চূড়া, যা ব্যাপনে দূরত্বের সঙ্গে চওড়া হয়; অল্প পরিমাণ, তাই বেশি ভরা নেই।
- একটি 25 cm কলাম, 4.6 mm চওড়া, 65% খোলা জায়গা, তাই t₀ = 2.7 mL ÷ প্রবাহের হার।
কিনারার বেলা
- Rf 0 কিংবা 1-র কাছে: যৌগ গোড়ার রেখায় কিংবা সামনের ধারে জমে যায় আর সেগুলো আলাদা করে চেনা যায় না। দ্রাবক বেছে নিয়ে প্রায় 0.2 আর 0.8-র মধ্যে Rf মানে নিশানা করুন।
- গোড়ার রেখার ওপরে দ্রাবক: দাগগুলো চলার বদলে তলার দ্রাবকে ধুয়ে মিশে যায়।
- রংহীন যৌগ আদৌ দেখতে একটি রং লাগে (অ্যামিনো অ্যাসিডে নিনহাইড্রিন, আয়োডিনের বাষ্প, একটি প্রতিপ্রভ পাতে UV আলো)।
- একই Rf প্রমাণ করে না যে দুটি যৌগ একই; সেগুলো একটি দ্বিতীয় দ্রাবকে চালান, কিংবা পাশাপাশি আর মিশিয়ে (একসঙ্গে দাগিয়ে)।
আদলটি কোথায় আর ঠিক থাকে না
- ল্যাজ টেনে যাওয়া আর বেশি ভরা। বেশি নমুনা, কিংবা সিলিকায় অ্যাসিডীয় ও ক্ষারীয় যৌগ, পরিষ্কার গোল দাগের বদলে ছোপ আর ধূমকেতুর আকারের দাগ বানায়।
- মেশানো দ্রাবক নিজেরাই আলাদা হয়ে যায়। একটি মিশেলের বেশি পোলার অংশটি পাত পিছিয়ে রাখে, তাই পাতের ওপরের দিকে দ্রাবকের গড়ন বদলে যায়, আর একটি শুকনো, না-ভরা ট্যাংক দ্রাবকটিকে ওঠার সময়ই পাত থেকে উবে যেতে দেয়; দুটিই Rf মান সরিয়ে দেয়।
- তাপমাত্রা আর আর্দ্রতা Rf বদলে দেয়, আর বাতাস থেকে পানি তুলে নেওয়া সিলিকা কম সক্রিয় হয়ে যায়।
- ঢালে ধোয়া, যেখানে একটি কলাম চলার সময়ই দ্রাবকটি ধীরে ধীরে জোরালো করা হয়, বেশির ভাগ HPLC এভাবেই হয়; এই আদল দ্রাবকটি বাঁধাই রাখে।
- অন্য কলকাঠি। আয়ন-বিনিময়, মাপ-বর্জন আর অনুরাগ ক্রোমাটোগ্রাফি আলাদা করে আধান, মাপ আর নির্দিষ্ট জোড়া বাঁধা ধরে, পোলারিটি ধরে নয়।
পাশের সরঞ্জাম
জেল তড়িৎচলনের সিমুলেটর DNA মাপ ধরে আলাদা করে, অর্থাৎ একটি মিশেল ভেঙে ফেলার একটি আলাদা পথ; স্পেকট্রোফোটোমিটার আর বিয়ার-লামবার্ট সূত্রের সিমুলেটর দেখায় একটি সন্ধানী কতটা যৌগ বেরিয়ে আসছে তা কীভাবে মাপে; আর 3D অণু দর্শক সেই পোলার গুচ্ছগুলো দেখায় যা অণুকে সেঁটে রাখে।