كيف يعمل الرحلان الكهربائي في الهلام وكيف تقرأ هلام DNA

ما الذي يحرّك الـ DNA

كل نوكليوتيد في الـ DNA يحمل شحنة سالبة على الفوسفات، ففي مجال كهربائي يتحرك الـ DNA نحو القطب الموجب (الأحمر؛ تذكّر «يجري نحو الأحمر»). وفي المحلول الحر تزداد الشحنة والاحتكاك معًا مع الطول، فقطعة من 100 bp وأخرى من 10,000 bp ستسيران بالسرعة نفسها. والذي يفصلهما هو الهلام: يكوّن الأغاروز شبكة من المسام، والجزيئات الأطول تتباطأ أكثر وهي تشق طريقها عبرها.

ما الذي يحدد أين تنتهي الحزمة

• طول القطعة. في المدى المفيد للهلام، تقع المسافة المقطوعة تقريبًا على خط مستقيم مع لوغاريتم الطول. ومضاعفة الحجم تُرجع الحزمة المسافة نفسها تقريبًا في أي نقطة من ذلك المدى.
• نسبة الأغاروز. الهلام الأكثف مسامه أصغر. تقريبًا: 0.7% لـ 5 إلى 20 kb، و1% لـ 0.5 إلى 10 kb، و1.5% لـ 0.2 إلى 3 kb، و2 إلى 3% لـ 50 bp إلى 1 kb.
• شدة المجال. السرعة تتناسب مع الفولتات لكل سنتيمتر بين القطبين، لا مع الجهد نفسه. المعتاد 5 إلى 8 V/cm؛ وهلام صغير في حوض قطباه على بعد 15 cm يعمل عند نحو 100 V.
• الشكل. البلازميد الفائق الالتفاف مضغوط ويسبق الـ DNA الخطي بالطول نفسه؛ والبلازميد المثلوم (دائرة مفتوحة) يزحف ويبقى خلفه؛ والـ RNA والسلاسل المفردة تنطوي وتسير بشكل غير متوقع.
• المحلول المنظم والصبغة. يفصل TAE القطع الكبيرة أفضل قليلًا، وTBE الصغيرة. ويبطئ بروميد الإيثيديوم الـ DNA قليلًا، وصبغات التحميل تسير مع قطع حجمها يعتمد على الهلام: أزرق البروموفينول مع نحو 300 إلى 500 bp في أغاروز 1%، والزايلين سيانول مع نحو 3 إلى 4 kb.

قياس حزمة بالسلّم

السلّم خليط من قطع معروفة الحجم يسير في مساره الخاص. قِس المسافة من البئر إلى كل حزمة من السلّم، وارسم log₁₀(الحجم) مقابل المسافة، ثم وفّق خطًا مستقيمًا: المنحنى المعياري. واقرأ على الخط حجم الحزمة المجهولة.

مثال: في هلام 1%، قطعت حزمة السلّم 3,000 bp مسافة 2.6 cm وحزمة 1,000 bp مسافة 4.0 cm. الخط المار بهما ميله (log₁₀ 1,000 − log₁₀ 3,000) ÷ (4.0 − 2.6) = −0.477 ÷ 1.4 = −0.341 لكل cm. وحزمة مجهولة عند 3.3 cm تقع عند log₁₀(الحجم) = log₁₀ 3,000 − 0.341 × 0.7 = 3.477 − 0.239 = 3.238، فحجمها 10^3.238 ≈ 1,730 bp. استخدم حزمتي السلّم المحيطتين بالمجهولة، أو خطًا موفقًا على عدة حزم، ولا تقرأ بعد آخر حزمة في السلّم.

كيف تقرأ النتائج المعتادة

• بلازميد غير مقطوع: حزمتان أو ثلاث، الفائقة الالتفاف في الأسفل، والمثلومة في الأعلى، وأحيانًا الخطية بينهما. ولا تقع أي منها عند الحجم الحقيقي للبلازميد بحسب سلّم خطي.
• بلازميد مخطَّط (قطع واحد): حزمة واحدة بالطول الكامل، وهي دليل جيد على أن إنزيمًا واحدًا قطع.
• هضم مزدوج: قطع يجب أن يساوي مجموعها حجم البلازميد. وإن لم يتساويا، فربما خرجت قطعة صغيرة من الهلام أو كانت باهتة جدًا، أو كانت قطعتان متقاربتا الحجم في حزمة واحدة.
• ناتج PCR: حزمة حادة بالحجم المتوقع. واللطخة تدل على قالب كثير أو دورات كثيرة؛ والحزم الزائدة على بادئات ترتبط حيث لا يجب؛ والحزمة الضبابية في أسفل الهلام على ثنائيات البادئات.

كيف تستخدم المحاكاة

في محاكي الرحلان الكهربائي في الهلام، تحمل المسارات من 1 إلى 6 سلّمًا، وبلازميدًا غير مقطوع، والبلازميد مقطوعًا مرة ومرتين، وناتج PCR، والأحجام التي تكتبها. يبدأ التشغيل فورًا. أوقفه حين تقطع جبهة أزرق البروموفينول نحو ثلاثة أرباع المسافة، ثم اقرأ الأحجام تحت الصورة، وكل منها مقدَّر بخط موفق على حزم السلّم التي لا تزال في الهلام. أشياء تجربها:

• اضبط المسار 6 على 100، 150، 200 وشغّل هلامًا 1%: تسير الثلاث معًا، أمام جبهة الصبغة مباشرة. أعده بنسبة 2.5% فتنفصل.
• اضبط المسار 6 على 20000، 30000، 48000 في أغاروز 1%: تتكدس في حزمة واحدة، وهي الحركية الحدّية.
• ارفع الجهد إلى 250 V: التشغيل سريع، لكن الحزم تتلطخ والمسارات الوسطى تسبق مسارات الحواف (الابتسامة) مع سخونة الهلام.
• اترك التشغيل يستمر: تخرج القطع الصغيرة والصبغة من النهاية وتضيع.

ما يفترضه النموذج

• صيغة حركية تجريبية، μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0.9) مع L* = 2,000 bp × (1% ÷ T)^1.4، اختيرت لتعطي مواضع واقعية في أغاروز من 0.5 إلى 3% مع TAE. إنها توفيق، لا نظرية لكيفية تحرك الـ DNA عبر المسام، وأرقامها نموذجية لا دقيقة لأي علامة تجارية من الأغاروز.
• حركية حدّية للـ DNA الطويل جدًا، لا تتباطأ تحتها أي قطعة أكثر؛ وفي أغاروز 1% تُبلغ عند نحو 20 kb.
• معاملات شكل ثابتة للبلازميدات: يسير الـ DNA الفائق الالتفاف كـ DNA خطي بطول 0.6 من طوله، والمثلوم كواحد بطول 1.8 منه. وفي الواقع تتغير المعاملات مع نسبة الهلام والجهد ودرجة الالتفاف الفائق ووجود بروميد الإيثيديوم في الهلام.
• كميات متساوية من كل قطعة في الهضم (متساوية المولات)، فسطوع الحزمة يتناسب مع طولها، و300 ng من الـ DNA لكل مسار عينة. وتحتاج الحزمة نحو 2 ng لتُرى.
• مجال وحرارة متجانسان في الهلام كله، و15 cm بين القطبين، ومقاومة محلول منظم 1.6 kΩ، مع عقوبة بسيطة للتسخين فوق 10 V/cm.
• عرض الحزمة بالانتشار زائد عرض البئر؛ ويُستبعد التحميل الزائد والملح في العينة والآبار غير المنتظمة، التي تشوّه الحزم الحقيقية.

الحالات الحدية

• القطع خارج السلّم تحمل علامة استفهام: يُمدّ الخط إلى ما بعد بياناته وقد يخطئ كثيرًا.
• قطعتان متقاربتان جدًا في الحجم تسيران كحزمة واحدة بضعف السطوع. لا يفضحهما إلا السطوع؛ وقد يفصلهما تشغيل أطول أو هلام أكثف.
• القطع الصغيرة جدًا (أقل من نحو 100 bp في أغاروز 1%) تسير مع جبهة الصبغة فتُحجب، والحزم الباهتة جدًا، تحت نحو 2 ng، لا تظهر أبدًا.
• قطعة أطول من البلازميد مستحيلة في هضم مزدوج؛ وإن كانت المسافة بين القطعين أكبر مما يسمح به البلازميد، تحدّها المحاكاة.
• التجاوز إلى النهاية: بعد خروج الصبغة من الهلام بقليل يتوقف التشغيل، ولا يمكن قياس الحزم التي خرجت.

أين يتوقف النموذج عن الصلاحية

• فوق نحو 20 إلى 50 kb يتحرك الـ DNA بالزحف الأفعواني، متلويًا وأحد طرفيه في المقدمة، فتسير كل القطع الطويلة معًا. وفصلها يتطلب رحلانًا بمجال نبضي، لا يستطيع النموذج وصفه.
• هلامات البولي أكريلاميد تفصل قطعًا تختلف بقاعدة واحدة، كما في السلسلة؛ والأغاروز لا يستطيع ذلك، والصيغة لا تصلح لها.
• البروتينات تُفصل في هلامات SDS-PAGE، بآلية أخرى (يغلّفها SDS بشحنة تتناسب مع طولها)؛ ولها استخدم حاسبة هلام SDS-PAGE.
• الـ DNA أحادي السلسلة والـ RNA ينطويان في أشكال تغيّر سرعتهما؛ ويحتاجان هلامات مُمسِّخة ليسيرا بحسب الحجم.
• الهلامات الحقيقية ليست متجانسة: التسخين غير المتساوي، أو الهلام المائل، أو الملح أو الـ DNA الزائد في مسار، تحني الحزم وتلطّخها بطرق يتعلم قارئ الهلامات التعرف عليها ولا يُظهرها نموذج.

الحاسبات

حضّر الهلام بـ حاسبة هلام الأغاروز (ودليلها، كيف تحضّر هلام الأغاروز)، وقِس الحزم بقياساتك في تقدير حجم حزمة في الهلام، وتنبأ بقطع هضم بـ خريطة التقييد.