طوران
لكل كروماتوغرافيا طور ثابت يبقى في مكانه (سليلوز الورق، وهلام السيليكا على صفيحة الطبقة الرقيقة، وحشوة العمود) وطور متحرك يمر عبره (مذيب، أو غاز في الكروماتوغرافيا الغازية). وكل مركب في الخليط يتنقل بلا توقف بين الاثنين: يتقدم حين يذوب في الطور المتحرك، وينتظر حين يلتصق بالطور الثابت. والمركب الذي يقضي وقتًا أطول ملتصقًا يتقدم أبطأ، فتنفصل المركبات التي تلتصق بقوى مختلفة.
النسبة بين زمن الالتصاق وزمن الحركة هي معامل الاحتجاز k. والمركب ذو k = 1 يقضي نصف وقته متحركًا ويتقدم بنصف سرعة المذيب.
القطبية
السيليكا والسليلوز قطبيان، مغطيان بمجموعات OH تكوّن روابط هيدروجينية. فالمركبات القطبية (السكريات والأحماض الأمينية والكلوروفيل b) تلتصق بهما، وغير القطبية (الكاروتين والدهون) بالكاد. ويتنافس المذيب على المواضع نفسها: فالأكثر قطبية يزيح المركبات القطبية ويحملها أبعد. لذلك على صفيحة سيليكا لا يحرّك الهكسان إلا المركبات غير القطبية، ويحرّك أسيتات الإيثيل المتوسطة القطبية، ويحرّك الإيثانول أو الماء كل ما يذوب تقريبًا. وأعمدة الطور المعكوس، المغطاة بسلاسل هيدروكربونية طويلة، تقلب ذلك: فيها تلتصق المركبات غير القطبية.
قيم Rf
على الورق أو صفيحة الطبقة الرقيقة، يصعد المذيب من الأسفل ويُوقف التشغيل قبل أن يبلغ القمة. وكل بقعة قطعت جزءًا ثابتًا من مسافة المذيب:
Rf = المسافة التي قطعتها البقعة ÷ المسافة التي قطعتها جبهة المذيب = 1 ÷ (1 + k)
تُقاس المسافتان من خط الأساس حيث وُضعت العينة. وتقع Rf بين 0 و1، ولصفيحة ومذيب وحرارة معينة يكون لكل مركب تقريبًا Rf نفسها في كل مرة، فيمكن مقارنة بقعة مجهولة بمعيار يُشغَّل بجانبها.
مثال محلول
يُشغَّل مستخلص سبانخ على صفيحة سيليكا بالهكسان والأسيتون، 9 إلى 1. تتوقف الجبهة على 6.0 cm من خط الأساس.
- بقعة برتقالية على 5.7 cm: Rf = 5.7 ÷ 6.0 = 0.95، بيتا-كاروتين، الصبغة الأقل قطبية.
- بقعة خضراء مزرقة على 2.7 cm: Rf = 0.45، الكلوروفيل a؛ k = 1 ÷ 0.45 − 1 = 1.2.
- بقعة خضراء مصفرة على 2.1 cm: Rf = 0.35، الكلوروفيل b، وفيه مجموعة C=O إضافية فهو أكثر قطبية.
- بقعة صفراء على 1.5 cm: Rf = 0.25، الزانثوفيلات، بمجموعات OH تتشبث بالسيليكا.
يتبع الترتيب القطبية، والأقل قطبية في الأعلى. والقيم المنشورة لهذه الأصباغ تختلف من مختبر إلى آخر بحسب الصفيحة وخليط المذيبات ومدى جفاف الصفيحة، ولهذا تُشغَّل المعايير بجانبها.
الأعمدة والكروماتوغرامات
في كروماتوغرافيا العمود (وفي HPLC والكروماتوغرافيا الغازية)، يتدفق الطور المتحرك عبر أنبوب محشو وتخرج المركبات من طرفه واحدًا تلو الآخر إلى كاشف يرسم قمة لكل منها. ويستغرق المذيب نفسه الزمن الميت t₀ لعبوره؛ والمركب ذو معامل الاحتجاز k يستغرق
tR = t₀ (1 + k)
تتسع القمم أثناء الرحلة، لأن الجزيئات تسلك مسارات مختلفة عبر الحشوة وتنتشر. وكفاءة العمود عدد صفائحه النظرية N: عرض القمة (الانحراف المعياري) σ = tR ÷ √N. لعمود HPLC جيد 10,000 صفيحة أو أكثر؛ ولعمود جاذبية محشو يدويًا ربما بضع مئات.
متابعةً للمثال على عمود بـ t₀ = 2.7 min وN = 2,000: يخرج الكلوروفيل a (k = 1.22) عند 2.7 × 2.22 = 6.0 min مع σ = 6.0 ÷ √2000 = 0.13 min؛ والكلوروفيل b (k = 1.86) عند 7.7 min مع σ = 0.17 min.
درجة الفصل
هل جاران منفصلان؟ يعتمد ذلك على المسافة بينهما وعلى عرضيهما معًا:
Rs = 2 (tR2 − tR1) ÷ (w₁ + w₂)، مع عرض القاعدة w = 4σ
للكلوروفيلين، Rs = 2 × 1.72 ÷ (0.54 + 0.69) = 2.8: منفصلان جيدًا. Rs = 1.5 تعطي فصلًا حتى خط القاعدة؛ وعند 1 تتداخل القمم نحو 2%؛ وتحت ذلك تندمج. وتبيّن معادلة بورنيل الطرق الثلاث لتحسينها:
Rs = (√N ÷ 4) × ((α − 1) ÷ α) × (k ÷ (1 + k))
مع α = k₂ ÷ k₁. العمود الأفضل (N أكبر) لا يفيد إلا بالجذر التربيعي؛ وتغيير المذيب لتغيير α، أي مدى اختلاف التصاق المركبين، يفيد عادةً أكثر بكثير.
كيف تستخدم المحاكاة
في محاكي الكروماتوغرافيا، أشياء تجربها:
- أصباغ الورق في الهكسان والأسيتون، ثم في الهكسان النقي: في الهكسان لا يتحرك إلا الكاروتين؛ وتبقى الكلوروفيلات قرب خط الأساس.
- الحبر الأسود في الماء: تنفصل الأصباغ؛ وفي الهكسان لا تتحرك إطلاقًا، لأنها لا تذوب.
- الأحماض الأمينية في البيوتانول وحمض الأسيتيك والماء: لا يظهر شيء حتى تحدد «اصبغ بالنينهيدرين»، وعندها يكاد اللوسين والفينيل ألانين يتداخلان.
- اجعل البقعة 6 mm: تكبر كل البقع وتندمج المتجاورة.
- في العمود، اخفض N من 2,000 إلى 200 وشاهد القمم تتسع ودرجة الفصل تنخفض.
ما يفترضه النموذج
- مقياس قطبية واحد. لكل مركب رقم قطبية، اختير لتطابق Rf له قيمة منشورة في مذيب مرجعي، ولكل مذيب رقم على مقياس من 0 إلى 1؛ k = e8(p − s). والاحتجاز الحقيقي يعتمد على الروابط الهيدروجينية والحموضة والحجم والشكل، لا على رقم واحد.
- الذوبانية كمفتاح. أصباغ الحبر لا تذوب إلا في المذيبات القطبية، وأصباغ الورق في أي مذيب عدا الماء، والأحماض الأمينية في المذيبات القطبية بما يكفي فقط؛ وإلا فـ Rf = 0.
- الطور الثابت نفسه للورق والطبقة الرقيقة والعمود.
- جبهة تصعد مع الجذر التربيعي للزمن (قانون لوكاس-واشبورن)، بسرعة تعتمد على المذيب.
- بقع وقمم غاوسية، تتسع مع المسافة بالانتشار؛ وكميات صغيرة، فلا تحميل زائد.
- عمود طوله 25 cm، قطره 4.6 mm وفراغه 65%، فـ t₀ = 2.7 mL ÷ معدل التدفق.
الحالات الحدية
- Rf قرب 0 أو 1: تتكدس المركبات عند خط الأساس أو عند الجبهة ولا يمكن تمييزها. استهدف قيم Rf بين 0.2 و0.8 تقريبًا باختيار المذيب.
- مذيب فوق خط الأساس: تذوب البقع في المذيب أسفل الوعاء بدل أن تجري.
- المركبات عديمة اللون تحتاج كاشفًا (النينهيدرين للأحماض الأمينية، أو بخار اليود، أو الأشعة فوق البنفسجية على صفيحة متفلورة) لتُرى أصلًا.
- تطابق Rf لا يثبت أن مركبين هما المركب نفسه؛ شغّلهما في مذيب ثانٍ، أو جنبًا إلى جنب ومخلوطين (التنقيط المشترك).
أين يتوقف النموذج عن الصلاحية
- الذيول والتحميل الزائد. العينة الكثيرة، أو المركبات الحمضية والقاعدية على السيليكا، تُنتج خطوطًا وبقعًا على شكل مذنّب بدل دوائر نظيفة.
- خلائط المذيبات تنفصل وحدها. يحتجز الصفيحة الجزء الأكثر قطبية من الخليط، فيتغير تركيب المذيب على امتداد الصفيحة، والوعاء الجاف غير المشبع يترك المذيب يتبخر من الصفيحة وهو يصعد؛ وكلاهما يزيح قيم Rf.
- الحرارة والرطوبة تغيّران Rf، والسيليكا التي امتصت ماء من الهواء تصبح أقل نشاطًا.
- الشطف المتدرج، حيث يصبح المذيب أقوى تدريجيًا أثناء تشغيل العمود، هو الطريقة التي يُجرى بها معظم HPLC؛ وهذا النموذج يُبقي المذيب ثابتًا.
- آليات أخرى. كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والاستبعاد الحجمي والألفة تفصل بالشحنة والحجم والارتباط النوعي، لا بالقطبية.
أدوات ذات صلة
يفصل محاكي الرحلان الكهربائي في الهلام الحمض النووي بحسب الحجم، وهي طريقة أخرى لتفكيك خليط؛ ويبيّن محاكي المطياف الضوئي وقانون بير-لامبرت كيف يقيس كاشف كمية ما يخرج من مركب؛ ويُظهر عارض الجزيئات ثلاثي الأبعاد المجموعات القطبية التي تجعل الجزيئات تلتصق.