شرح قانون بير-لامبرت: الامتصاصية، والنفاذية، وأطياف الامتصاص، ومنحنيات المعايرة

كيف يعمل المطياف الضوئي

يعطي مصباح ضوءًا أبيض (مصباح تنغستن للمرئي، ومصباح ديوتيريوم لفوق البنفسجي). ويختار أحادي اللون، وهو منشور أو محزوز حيود مع شق، نطاقًا ضيقًا من الأطوال الموجية. يعبر ذلك الضوء العينة في خلية ويصل إلى كاشف. يُقاس أولًا الشاهد، الخلية بالمذيب وحده، فيعطي I₀؛ ثم تعطي العينة I. وقسمة أحدهما على الآخر تلغي سطوع المصباح وانعكاسات الخلية وامتصاص المذيب نفسه.

النفاذية والامتصاصية

T = I ÷ I₀، A = −log₁₀ T

النفاذية جزء الضوء الذي يعبر. والامتصاصية لوغاريتمها السالب، الذي يحوّل طريقة خفوت الضوء في العينة، الجزء نفسه في كل مليمتر، إلى رقم يزيد خطيًا مع كمية المادة الماصة:

A = 0: يعبر كل الضوء.
A = 1: يعبر 10%.
A = 2: ‏1%. ‏A = 3: ‏0.1%.

قانون بير-لامبرت

A = ε l c

ε امتصاصية المادة عند ذلك الطول الموجي: مدى قوة امتصاصها. وبوحدة M⁻¹ cm⁻¹ هي الامتصاصية المولية، أو معامل الخمود.
l طول المسار الضوئي عبر العينة، 1 cm في خلية قياسية.
c التركيز.

إن ضاعفت التركيز أو المسار، تضاعفت الامتصاصية. ويتيح القانون تحويل امتصاصية مقيسة مباشرة إلى تركيز متى عُرفت ε.

أمثلة محلولة

برمنغنات البوتاسيوم لها ε = 2,455 M⁻¹ cm⁻¹ عند 525 nm. محلول 80 µM في خلية 1 cm: ‏A = 2,455 × 1 × 0.000080 = 0.196، ‏T = 10^−0.196 = 63.7%.
البروتين: يمتص ألبومين مصل البقر 0.667 لكل mg/mL ولكل cm عند 280 nm، بفضل التريبتوفان والتيروزين فيه. وقراءة 0.40 تعني 0.40 ÷ 0.667 = 0.60 mg/mL.
الحمض النووي: الـ DNA مزدوج السلسلة بتركيز 50 µg/mL يعطي A₂₆₀ = 1.0. وعينة مخففة 1 إلى 10 تقرأ 0.25 تحتوي 0.25 × 50 × 10 = 125 µg/mL. وللـ DNA النقي نسبة A₂₆₀ ÷ A₂₈₀ نحو 1.8؛ والنسبة الأقل توحي بأنه يحتوي بروتينًا.

أطياف الامتصاص

رسم الامتصاصية مقابل الطول الموجي يعطي طيف امتصاص المادة. قِس عند قمته، λ_max: القراءة هناك أكبر، فهي الأكثر حساسية، والمنحنى مسطح هناك، فتقل أهمية أخطاء الطول الموجي الصغيرة. ولون المحلول هو لون الضوء الذي لا يمتصه: البرمنغنات تمتص الأخضر (نحو 525 nm) فتبدو أرجوانية؛ وكبريتات النحاس تمتص الأحمر والأشعة تحت الحمراء القريبة (نحو 800 nm) فتبدو زرقاء فاتحة.

منحنيات المعايرة

كثيرًا ما لا تُعرف ε للعينة وظروفها بالضبط، أو يلزم فحص الجهاز. فتُقاس سلسلة معايير معلومة التركيز، وتُرسم الامتصاصية مقابل التركيز ويُطابق خط مستقيم A = m c + b. وتركيز المجهولة c = (A − b) ÷ m.

مثال: معايير برمنغنات 0 و25 و50 و100 µM تقرأ 0.000 و0.061 و0.123 و0.245. الميل المطابق 0.00245 لكل µM مع تقاطع قرب الصفر. والمجهولة التي تقرأ 0.150 فيها 0.150 ÷ 0.00245 = 61 µM. لا تثق بالنتيجة إلا ضمن مدى المعايير، وإلا إن كان R² قريبًا من 1.

كيف تستخدم المحاكاة

في محاكي المطياف الضوئي وقانون بير-لامبرت، أشياء تجربها:

البرمنغنات عند قمتها: ضاعف التركيز فتتضاعف الامتصاصية، بينما تنخفض النفاذية من 64% إلى 41%.
اقسم طول المسار على اثنين: تنقسم الامتصاصية على اثنين.
ارفع التركيز إلى أقصاه: تبقى الامتصاصية المقيسة تحت خط بير-لامبرت وتتسطح قرب 3 بسبب الضوء الشارد. ألغِ تحديد «احسب 0.1% من الضوء الشارد» فيتطابقان.
افتح الشق إلى 20 nm على قمم البرمنغنات الضيقة: تنخفض امتصاصية القمة ويصبح الطيف أنعم.
اختر DNA عند 260 nm في خلية بلاستيكية: تمتص الخلية معظم فوق البنفسجي وتصبح القراءة ضجيجًا.
أضف أربعة معايير، وقِس المجهولة، وقارن النتيجة بالقيمة الحقيقية المعروضة.

ما يفترضه النموذج

أطياف امتصاص مبنية من قمم ناعمة، مُعايرة على قيم منشورة عند طول موجي واحد: البرمنغنات 2,455 M⁻¹ cm⁻¹ عند 525 nm، وكبريتات النحاس نحو 12.5 M⁻¹ cm⁻¹ عند 810 nm، والألبومين 0.667 لكل mg/mL عند 280 nm، والـ DNA ‏0.020 لكل µg/mL عند 260 nm. والأشكال في المواضع الأخرى تقريبية.
نطاق شق مثلثي: تأخذ القراءة متوسط النفاذية على ± عرض الشق.
ضوء شارد بنسبة 0.1% يصل إلى الكاشف دون أن يعبر المادة عند الطول الموجي المختار.
الخلايا: الكوارتز ينفذ في كامل المدى من 200 nm؛ والبوليسترين يتوقف عن النفاذ تحت نحو 300 nm.
قليل من ضجيج الكاشف، فتتذبذب القراءات في الخانة الأخيرة وتفقد موثوقيتها حين لا يكاد يعبر ضوء.
يلغي الشاهد الخلية والمذيب تمامًا، وللمجهولة تركيز عشوائي جديد لكل محلول بعد «إعادة ضبط».

الحالات الحدية

التركيز صفر يعطي A = 0، عدا الضجيج، لأن الشاهد هو الخلية نفسها بالمذيب نفسه.
أطوال موجية لا يمتص فيها شيء تعطي A ≈ 0 عند أي تركيز؛ فكبريتات النحاس بالكاد تمتص في الأخضر.
الامتصاصية العالية جدًا تبلغ سقفًا قرب −log₁₀ للضوء الشارد: نحو 3 لـ 0.1%.
معايير عند طول موجي والمجهولة عند آخر تعطي نتيجة بلا معنى؛ والمحاكاة تنبّه إلى ذلك.

أين يتوقف النموذج عن الصلاحية

المحاليل المركزة. فوق نحو 10 mM، تكون الجزيئات متقاربة جدًا فيؤثر بعضها في امتصاص بعض، ويتغير معامل الانكسار؛ فينحني الخط حتى مع جهاز مثالي.
الكيمياء في الخلية. الأصباغ التي تتزاوج، والأحماض والقواعد التي يعتمد لونها على pH، والمعقدات التي تتفكك عند التخفيف، كلها تغيّر ε مع التركيز.
التشتت. العينات العكرة والخلايا والرواسب تحرف الضوء بعيدًا عن الكاشف، فيُقرأ ذلك امتصاصيةً غير موجودة؛ وهذا بالضبط ما تقيسه عمدًا الكثافة الضوئية OD600 لمزرعة بكتيرية.
التفلور. العينة التي تعيد إصدار جزء من الضوء قد ترسله إلى الكاشف فتعطي قراءة منخفضة.
البروتينات مختلفة. رقم 0.667 خاص بالألبومين؛ وللبروتينات الأخرى كميات أخرى من التريبتوفان والتيروزين وقد تمتص نصف ذلك أو ضعفه لكل mg/mL.

الحاسبات

احسب أي حد في A = εlc بـ حاسبة قانون بير-لامبرت، وطابق قراءاتك بـ حاسبة المنحنى القياسي، واحسب تراكيز الأحماض النووية والبروتينات بـ حاسبة تركيز DNA وحاسبة تركيز البروتين (A280). ويتعمق الدليلان كيف ترسم منحنى قياسيًا وكيف تقيس تركيز البروتين عند A280 أكثر.

شرح قانون بير-لامبرت: الامتصاصية والمطيافات الضوئية ومنحنيات المعايرة