ما يحتاجه الدليل
لـ SpCas9 المعتاد، الدليل 20 قاعدة تطابق الـ DNA الهدف، ويجب أن يلي الهدفَ مباشرةً PAM من نوع NGG على السلسلة نفسها. يقطع Cas9 قبل الـ PAM بثلاث قواعد. والـ PAM ليس جزءًا من الدليل.
قد تكون المواقع على أي من السلسلتين: NGG على السلسلة السفلى يظهر CCN على العليا.
كيف تختار بين المواقع
- الموضع. لتعطيل جين، استهدف إكسونًا مبكرًا مشتركًا بين كل النسخ، كي تُفسد إزاحات الإطار البروتين. وللتعديل الدقيق، يجب أن يقع القطع على بعد نحو 10 قواعد من التغيير.
- نسبة GC من 40 إلى 80%. مع GC قليل جدًا يرتبط ضعيفًا؛ ومع الكثير، قد يرتبط بسهولة في مواقع أخرى.
- بلا TTTT. أربع T متتالية تُنهي النسخ من محفّز U6 الذي تستخدمه معظم بلازميدات الأدلة.
- G في البداية يساعد النسخ من U6؛ وإن لم يكن موجودًا، تضيفه بروتوكولات كثيرة.
التأثيرات خارج الهدف
قد يقطع الدليل أيضًا مواقع تختلف في قواعد قليلة، لا سيما إن كانت عدم التطابقات بعيدة عن الـ PAM. قبل طلبها، قارن أدلتك المختارة بالجينوم كله بأداة بحث جينومي، واحتفظ بالتي ليس لها تطابقات قريبة.
اعثر على مواقع مرشحة
الصق تسلسلك الهدف في باحث أدلة CRISPR. يسرد كل المواقع على السلسلتين مع موضعها وسلسلتها ونسبة GC، لـ NGG وأنواع PAM أخرى. واستخدم خريطة التقييد لتخطيط هضم للفحص حول موضع القطع.
موقع محلول
في التسلسل أدناه موقع واحد صالح على أي من السلسلتين، NGG أمامه 20 قاعدة كاملة:
ATGGCTAGCAAGGAGT TCATCCGTGACCTGAAGTTC TGG TAA- الدليل: TCATCCGTGACCTGAAGTTC، القواعد من 17 إلى 36.
- الـ PAM: TGG، القواعد من 37 إلى 39.
- نسبة GC: 10 من 20 قاعدة، 50%.
- القطع: بين القاعدتين 33 و34، قبل الـ PAM بثلاث قواعد.
طلب الأوليغوات للاستنساخ
كثير من بلازميدات Cas9 تستقبل الدليل كأوليغوين ملدّنين بأطراف تناسب الناقل المقطوع. يبدأ الدليل بـ T، فتُضاف G لمحفّز U6:
Forward: 5′-CACCG TCATCCGTGACCTGAAGTTC-3′
Reverse: 5′-AAAC GAACTTCAGGTCACGGATGA C-3′الأوليغو العكسي هو المتمم العكسي للدليل، مع C في طرفه 3′ تقترن بالـ G المضافة.
مشكلات شائعة
- تعديل قليل. تختلف الأدلة كثيرًا في جودة قطعها. اطلب اثنين أو ثلاثة لكل هدف واحتفظ بالأفضل.
- الخلايا المعدّلة لا تزال تنتج البروتين. الإدخالات والحذوفات بطول 3 أو 6 أو 9 قواعد تحافظ على إطار القراءة. افحص عدة نسائل واختر دليلًا في إكسون مهم لوظيفة البروتين.
- التعديل لا يظهر في الهلام. الإدخالات والحذوفات الصغيرة لا تغيّر حجم الشريط. استخدم اختبار قطع عدم التطابق، أو سلسلة ناتج الـ PCR، أو موقع تقييد يدمّره القطع.