باحث أدلة CRISPR

كيف تبحث عن أدلة CRISPR

1. الصق DNA الذي تريد قطعه، كنص عادي أو بصيغة FASTA.
2. اختر النوكلياز وPAM الخاص به، أو اكتب PAM خاصًا بك، وحدد طول الدليل.
3. حدد مدى GC وهل تريد استبعاد الأدلة التي فيها امتداد TTTT.
4. يظهر كل دليل مع موضعه وسلسلته وتسلسله وPAM ومحتوى GC فيه. «نسخ الناتج» أو «تنزيل» يحفظ النتيجة.

الأسئلة الشائعة

ما PAM؟

موتيف قصير يجب أن يرتكز عليه النوكلياز بجوار هدفه. يحتاج SpCas9 إلى NGG مباشرة بعد الـ 20 nt للدليل؛ ويحتاج Cas12a إلى TTTV مباشرة قبل دليل أطول. دون PAM لا يوجد قطع.

ما محتوى GC المناسب؟

بين 35% و75% يصلح لمعظم الأدلة، وبين 40% و60% هو المعتاد. محتوى GC المنخفض جدًا يرتبط بضعف، والعالي جدًا يزيد القطع خارج الهدف.

لماذا أستبعد الأدلة التي فيها TTTT؟

امتداد من أربعة T أو أكثر قد يعمل كإشارة إنهاء لمحفِّز U6 الذي يُعبَّر به عن الدليل، فيخرج sgRNA مبتورًا.

ماذا يعني عمود البذرة؟

عدد المواضع الأخرى في التسلسل الذي لصقته التي تظهر فيها القواعد الاثنتا عشرة نفسها بجوار PAM. أي قيمة أكبر من الصفر تعني أن الدليل ليس فريدًا حتى داخل هذا التسلسل، فافحصه مقابل الجينوم كله قبل طلبه.

هل يبحث عن أهداف خارج الهدف في الجينوم؟

لا. يبحث فقط في التسلسل الذي تلصقه، لأن البحث في الجينوم كله يحتاج إلى الجينوم. استخدمه لاختيار مبدئي ثم قيّم تلك القائمة القصيرة مقابل كائنك.

هل يُرفع تسلسلي؟

لا. كل شيء يعمل في متصفحك، فلا تغادر تسلسلاتك جهازك أبدًا.