Cálculos de laboratório de biologia molecular: guia de estudo

Ideias principais

A bancada de biologia molecular funciona com um pequeno conjunto de cálculos: quanto DNA há em um tubo, como diluí-lo, quanto inserto ligar e a que temperatura um iniciador se anela.

• DNA de fita dupla com A₂₆₀ = 1 é cerca de 50 µg/mL. Multiplique pelo fator de diluição, e por 40 para RNA e 33 para DNA de fita simples.
• A regra de Wallace para iniciadores curtos é Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C), em °C. Anele alguns graus abaixo da menor Tm do par.
• Para a ligação, massa de inserto = razão molar × massa de vetor × (comprimento do inserto ÷ comprimento do vetor).
• Uma diluição seriada multiplica os fatores, então três passos 1:10 dão 1:1000. Número de cópias = massa × 6,022 × 10²³ ÷ (comprimento × 660 × 10⁹), com a massa em nanogramas.

Equações principais

• conc (µg/mL) = A₂₆₀ × 50 × dilution
• Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
• insert ng = ratio × vector ng × insert length ÷ vector length
• copies = mass × 6.022×10²³ ÷ (length × 660 × 10⁹)

Exemplo resolvido

Uma diluição 1:10 de uma amostra de DNA dá A₂₆₀ = 0,50, então a amostra original é 0,50 × 50 × 10 = 250 µg/mL. Um iniciador de 20 nucleotídeos com 10 A ou T e 10 G ou C tem Tm = 2 × 10 + 4 × 10 = 60 °C. Para um vetor de 3 kb a 50 ng e um inserto de 1 kb com razão molar 3:1, inserto = 3 × 50 × (1 ÷ 3) = 50 ng.

Erros comuns

• Esquecer o fator de diluição ao converter uma leitura de A₂₆₀ em concentração.
• Usar uma razão em massa quando se pede razão molar.
• Usar a regra de Wallace para iniciadores longos, onde são necessárias fórmulas ajustadas por sal.

Prática

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