Moleküler biyoloji laboratuvarı hesapları: çalışma rehberi

Temel fikirler

Moleküler biyoloji tezgâhı küçük bir hesap kümesiyle yürür: tüpte ne kadar DNA olduğu, nasıl seyreltileceği, ne kadar insert bağlanacağı ve bir primerin hangi sıcaklıkta bağlanacağı.

• A₂₆₀ = 1 olan çift sarmal DNA yaklaşık 50 µg/mL’dir. Seyreltme çarpanıyla çarpın; RNA için 40, tek sarmal DNA için 33 ile.
• Kısa primerler için Wallace kuralı Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)’dir, °C cinsinden. Çiftin düşük Tm’sinin birkaç derece altında bağlayın.
• Ligasyonda insert kütlesi = molar oran × vektör kütlesi × (insert uzunluğu ÷ vektör uzunluğu)’dur.
• Seri seyreltme çarpanları çarpar; bu yüzden üç 1:10 adımı 1:1000 verir. Kopya sayısı = kütle × 6,022 × 10²³ ÷ (uzunluk × 660 × 10⁹); kütle nanogram cinsindendir.

Temel denklemler

• conc (µg/mL) = A₂₆₀ × 50 × dilution
• Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
• insert ng = ratio × vector ng × insert length ÷ vector length
• copies = mass × 6.022×10²³ ÷ (length × 660 × 10⁹)

Çözümlü örnek

Bir DNA örneğinin 1:10 seyreltmesi A₂₆₀ = 0,50 okur; yani stok 0,50 × 50 × 10 = 250 µg/mL’dir. 10 A veya T ile 10 G veya C içeren 20 nükleotitlik bir primerin Tm’si 2 × 10 + 4 × 10 = 60 °C’dir. 50 ng’lık 3 kb’lik vektör ve 3:1 molar oranda 1 kb’lik insert için insert = 3 × 50 × (1 ÷ 3) = 50 ng’dır.

Sık yapılan hatalar

• A₂₆₀ okumasını derişime çevirirken seyreltme çarpanını unutmak.
• Molar oran istenirken kütle oranı kullanmak.
• Tuz düzeltmeli formüllerin gerektiği uzun primerler için Wallace kuralını kullanmak.

Alıştırma

Bu konudaki alıştırma sorularıyla kendinizi sınayın: Moleküler biyoloji laboratuvarı hesapları