Главные идеи
Работа за лабораторным столом по молекулярной биологии держится на небольшом наборе расчётов: сколько ДНК в пробирке, как её развести, сколько вставки лигировать и при какой температуре отжигается праймер.
- Двухцепочечная ДНК при A₂₆₀ = 1 — около 50 мкг/мл. Умножайте на коэффициент разведения, а для РНК на 40 и для одноцепочечной ДНК на 33.
- Правило Уоллеса для коротких праймеров: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C), в °C. Отжигайте на несколько градусов ниже меньшей Tm пары.
- Для лигирования масса вставки = мольное отношение × масса вектора × (длина вставки ÷ длина вектора).
- Серийное разведение перемножает коэффициенты, поэтому три шага 1:10 дают 1:1000. Число копий = масса × 6,022 × 10²³ ÷ (длина × 660 × 10⁹), масса в нанограммах.
Основные формулы
conc (µg/mL) = A₂₆₀ × 50 × dilutionTm = 2(A+T) + 4(G+C)insert ng = ratio × vector ng × insert length ÷ vector lengthcopies = mass × 6.022×10²³ ÷ (length × 660 × 10⁹)
Разобранный пример
Разведение пробы ДНК 1:10 даёт A₂₆₀ = 0,50, значит исходный раствор содержит 0,50 × 50 × 10 = 250 мкг/мл. У 20-звенного праймера с 10 A или T и 10 G или C Tm = 2 × 10 + 4 × 10 = 60 °C. Для вектора 3 т.п.н. в количестве 50 нг и вставки 1 т.п.н. при мольном отношении 3:1 вставка = 3 × 50 × (1 ÷ 3) = 50 нг.
Частые ошибки
- Забывание коэффициента разведения при пересчёте показания A₂₆₀ в концентрацию.
- Использование массового отношения, когда требуется мольное.
- Применение правила Уоллеса для длинных праймеров, где нужны формулы с поправкой на соль.
Практика
Проверьте себя на тренировочных вопросах по этой теме: Расчёты в лаборатории молекулярной биологии